拟南芥镁离子转运蛋白AtMGT4的功能研究

摘要

Mg2+是植物生长发育所必需的大量元素之一，参与光合作用及各种新陈代谢进程。拟南芥Mg2+转运蛋白家族AtMGT与细菌的CorA家族同源，已在细菌及酵母中证明具有Mg2+转运能力。近几年，AtMGT家族的几个成员在拟南芥体内承担的生理功能得到了进一步阐述，但是AtMGT4在拟南芥体内行使怎样的功能还没有任何文献报道。因此，对AtMGT4在拟南芥的生长发育中的功能进行研究，可以丰富人们对AtMGT家族基因生物学功能的了解，加深对植物在器官、组织、细胞水平转运Mg2+的机制的认识。
　　本文以AtMGT4转座子插入缺失突变体为材料，利用分子、细胞学等技术手段来探讨该基因的功能，获得如下结果:
　　首先，鉴定得到Ler.背景的AtMGT4突变体，命名为mgt4-1。从+/mgt4-1自交后代中无法得到纯合突变体。利用Hoechst33342荧光染料观察花粉细胞核形态发现+/mgt4-1约有50％的花粉无细胞核，为败育花粉;利用+/mgt4-1与Ler.生态型进行正反交实验，+/mgt4-1（♀）×Ler.（♂）子代杂合型与野生型各占一半，Ler.（♀）×+/mgt4-1(♂)子代基因型全部为野生型。在Col.生态型中利用AtMGT4自身启动子启动AtMGT4-RNAi同样会导致花粉败育，同时在mgt4-1中恢复AtMGT4表达又可以恢复花粉育性，这些实验结果表明AtMGT4缺失会导致拟南芥花粉败育。
　　其次，对突变体花粉的败育时期进行了研究。利用Hoechst33342荧光染料观察不同发育时期的花粉细胞核形态，+/mgt4-1在二胞花粉期即有约50％的花粉粒细胞核已经降解，同时细胞出现明显皱缩;利用石蜡切片观察拟南芥花药及花粉的发育过程，+/mgt4-1约有一半的花粉在花药发育的S11期开始出现皱缩，细胞内出现苏木精染液无法着色的空泡。这些实验结果表明+/mgt4-1中的花粉败育发生在二胞花粉期。
　　再次，对基于GUS报告基因的组织表达模式进行了分析，发现AtMGT4主要在拟南芥的根尖、侧根发生处、根茎过渡区、茎端分生组织以及维管组织等部位表达。而在生殖器官中，AtMGT4在花药绒毡层及二胞、三胞、成熟花粉中有显著表达。
　　接着，对AtMGT4的亚细胞定位进行了观察。将内质网红色荧光标记物Bip-RFP与AtMGT4-EGFP共转化拟南芥叶肉原生质体，在激光共聚焦显微镜下RFP荧光与EGFP荧光可以较好地重叠，表明AtMGT4定位于细胞的内质网上。
　　另外，为进一步探讨AtMGT4在营养器官中的功能，构建了花粉表达但营养体缺失AtMGT4的嵌合体突变株。利用花药特异性表达的AtMGT5启动子，在+/mgt4-1背景下用AtMGT5启动子驱动AtMGT4表达，得到了花粉育性正常而营养体缺失AtMGT4的嵌合突变体，简写为mgt4-1，并对该突变体的表型进行了分析。在3 mM Mg2+条件下，mgt4-1与Ler.的长势基本一致;而在0.01 mM Mg2+下，萌发后第4天mgt4-1子叶发黄，明显小于Ler.，下胚轴也较Ler.短，进一步生长后与Ler.比较发现mgt4-1表现出植株矮小、侧根稀少的表型。
　　利用整体透明技术观察了mgt4-1子叶栅栏细胞的大小及数目。在3 mM Mg2+生长条件下，mgt4-1子叶栅栏细胞较Ler.稍小，而细胞数目与Ler.无明显差异;在0.01 mM Mg2+生长条件下，mgt4-1子叶栅栏细胞无论是大小还是数目均显著低于Ler.，该实验结果表明在0.01 mM Mg2+低镁条件下，mgt4-1子叶的细胞大小及数目均低于Ler.，导致mgt4-1表现出植株矮小的表型。
　　利用ICP-OES技术分析了不同Mg2+条件下，mgt4-1体内的Mg2+含量。在3 mM Mg2+生长条件下，mgt4-1地上部分的Mg2+含量显著低于Ler.，而地下部分的Mg2+含量mgt4-1与Ler.无明显差别;在0.01mM Mg2+生长条件下，mgt4-1无论是地上部分还是地下部分的Mg2+均显著低于Ler.。Ler.地上部分与地下部分Mg2+之比在3 mM Mg2+生长条件下为1.6∶1，而在0.01 mM Mg2+下这一比例降为1∶1;而mgt4-1地上部分与地下部分Mg2+之比不论在3 mM Mg2+还是0.01 mM Mg2+下都接近1∶1，表明在mgt4-1体内，Mg2+在地上部分和地下部分之间的分配不会响应外界Mg2+浓度的变化。
　　实时荧光定量PCR分析表明低镁条件下mgt4-1在受到ER-stress诱导物衣霉素刺激时，能够上调AtBip1、AtBip2、AtCNX1、AtCRT1a、AtCRT1b的表达水平，但其中AtCRT1b的上调倍数明显高于Ler.。另外，在0.01 mM Mg2+低镁条件下mgt4-1体内的AtCRT3（参与拟南芥油菜素内酯信号调控）表达水平显著高于Ler.。
　　综上所述，AtMGT4不仅在拟南芥花粉正常发育的维持，而且在植物营养体对低镁环境的适应中，都有重要作用。这些功能是通过AtMGT4调节细胞内质网中的Mg2+平衡来保障的。内质网中Mg2+含量可能影响AtCRT3的表达，从而协调BR信号通路来调控细胞分裂、生长及雄性育性。

目录

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 镁元素的生物学功能

1．2 Mg2+检测方法概述

1．3 生物体Mg2+转运蛋白研究进展

1．3．1 细菌Mg2+转运蛋白研究进展

1．3．2 酵母Mg2+转运蛋白研究进展

1．3．3 拟南芥中Mg2+转运蛋白研究进展

1．4 拟南芥花粉的发育概述

1．4．1 雄性生殖细胞分化及小孢子发生

1．4．2 雄配子体发生及发育

1．5 本研究的目的与意义

第二章 AtMGT4在拟南芥花粉发育中的作用研究

2．1 材料与方法

2．1．1 拟南芥材料、菌株及质粒

2．1．2 仪器、酶及试剂

2．1．3 AtMGT4突变体鉴定

2．1．4 植物组织总RNA提取及RT-PCR

2．1．5 花粉的扫描电镜观察

2．1．7 拟南芥花的人工杂交

2．1．8 重组质粒的构建

2．1．9 农杆菌介导的拟南芥遗传转化方法

2．1．10 基于GUS报告基因的AtMGT4表达模式分析

2．1．11 拟南芥花药石蜡切片

2．1．12 拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达目的蛋白

2．1．13 拟南芥胚胎的透明观察

2．1．14 质粒大量提取

2．1．15 生物信息学分析所需软件及数据库

2．2 结果与分析

2．2．1 +／mgt4-1突变体花粉育性分析

2．2．2 AtMGT4pro∷AtMGT4-RNAi株系及mgt4-1+AtMGT4pro∷AtMGT4功能互补株系花粉育性分析

2．2．3 +／mgt4-1花粉败育过程的细胞学观察

2．2．4 AtMGT4组织表达模式分析

2．2．5 AtMGT4亚细胞定位分析

2．3 讨论

2．3．1 内质网中的Mg2+平衡可能参与维持花粉的正常发育

2．3．2 AtMGT4可能与其它AtMGTs存在相互作用

第三章 AtMGT4在拟南芥幼苗生长发育中的作用研究

3．1 材料与方法

3．1．1 拟南芥材料、菌株及质粒

3．1．2 拟南芥子叶细胞大小及数量测量

3．1．3 ICP-OES法测定拟南芥各组织Mg含量

3．1．4 SYBR Green实时荧光定量PCR

3．2 结果与分析

3．2．1 低镁条件下mgt4-1表型观察及分析

3．2．2 低镁条件下mgt4-1体内Mg2+含量分析

3．2．3 低镁条件下mgt4-1体内内质网应激相关基因表达水平分析

3．3 讨论

3．3．1 AtMGT4参与维持拟南芥内质网腔的Mg2+平衡

3．3．2 低镁条件下AtMGT4可能协调其它信号通路共同维持拟南芥正常的生长发育

结语与展望

参考文献

论文发表情况

致谢

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