CaMKII基因在运动抗心脏功能增龄衰退中的作用

摘要

目的：基于Ca2+信号通路基因表达改变可能是增龄果蝇心脏功能衰退和运动抗心脏功能增龄衰退的潜在机理之一的设想，利用定位UAS-RNAi系统筛选增龄果蝇心功能密切相关心肌Ca2+信号调控基因。以筛选结果为基础，研究候选基因CaMKⅡ心肌沉默对增龄果蝇心脏运动适应效应的影响，从心脏功能，活动指数，攀爬能力和生命周期四个方面综合评价CaMKⅡ基因在运动延缓心脏功能增龄衰退效应中的作用。
　　方法：经过同源基因查找及比对分析，选定与哺乳动物心肌细胞Ca2+信号通路高度保守的果蝇基因作为目标基因。基于定位UAS-RNAi系统，将心脏特异性Gal4品系果蝇分别与UAS序列控制下Ca2+信号基因RNAi品系果蝇杂交，构建单个Ca2+信号基因心肌组织沉默品系果蝇。采用M-mode方法对1周龄（约为人类青少年时期）和5周龄（约为人类中老年时期）成体果蝇心脏功能衰退相关FS、AI、FL等指标进行检测，筛选出增龄果蝇心功能密切相关心肌Ca2+信号调控基因作为候选基因。构建候选基因CaMKⅡ心肌组织沉默表型，全身沉默表型和正常表达品系，每个品系设安静对照组和运动组。应用新型果蝇运动装置对运动组果蝇进行为期3周规律运动训练，采用M-mode方法观察安静对照组和运动组运动训练期前后心脏功能增龄衰退相关缩短分数、节律不齐指数、纤维性颤动时间等指标变化。在果蝇运动训练期结束后，使用DAMS3系统监测每个组别果蝇昼夜活动节律变化，摄像评定果蝇攀爬能力，统计不同组别果蝇存活率，制作生存曲线，综合研究CaMKⅡ基因在运动延缓心脏功能增龄衰退效应的作用。
　　结果：⑴果蝇CaMKⅡ基因的12种剪切体亚型与人类同源基因CaMKⅡδ的剪切体亚型序列对比结果显示，序列一致性均在74％以上，序列相似性均在82％以上，Blast序列相似性得分较高，确定果蝇CaMKⅡ基因与人类同源基因CaMKⅡδ高度保守。⑵Real-time PCR结果显示，Hand＞ UAS-CaMKⅡ RNAi-C果蝇心脏CaMKⅡ表达量相对于CaMKⅡ RNAi/+-C果蝇下降了79.70％; Arm/U AS-CaMKⅡ RN Ai-C果蝇体内CaMKⅡ表达量相对于CaMKⅡRNAi/+-C果蝇下降了64.54％。⑶随着年龄的增长，果蝇HP和DI延长，FS降低，AI和FL上升。2周龄或4周龄心肌特异性CaMKⅡ敲低果蝇FS较同龄CaMKⅡ基因正常表达果蝇显著下降;4周龄或6周龄Hand＞ CaMKⅡ RNAi-C组果蝇AI较CaMKⅡ RNAi/+-C组果蝇上升;不同周龄Hand＞ CaMKⅡRNAi-C组果蝇较同龄CaMKⅡ RNAi/+-C组果蝇FL上升。CaMKⅡRNAi/+-E组果蝇FS和DD相对于CaMKⅡ RNAi/+-C组果蝇显著增高;Hand＞ CaMKⅡRNAi-E组果蝇AI较Hand＞ CaMKⅡ RNAi-C组果蝇显著下降。⑷LD条件或DD条件下，运动组果蝇黑夜睡眠时间较同基因型对照组果蝇显著延长。⑸6周龄或7周龄心肌CaMKⅡ基因敲减果蝇攀爬能力显著低于同龄CaMKⅡ基因正常表达组(P＜0.001);6周龄CaMKⅡ RNAi/+-E组果蝇攀爬能力较同龄同基因型对照组果蝇明显下降(P＜0.001);不同周龄Hand＞ CaMKⅡ RNAi-E组果蝇攀爬能力均明显低于Hand＞CaMKⅡ RNAi-C组果蝇(P＜0.001)。⑹Hand＞CaMKⅡ RNAi-C组果蝇中位生存期为55天与中位生存期为67天的CaMKⅡ RNAi/+-C组果蝇相比差异明显（图14A）;Hand＞CaMKⅡ RNAi-E组果蝇中位生存期为64天，显著高于Hand＞CaMKⅡ RNAi-C组中位生存期为55天果蝇。
　　结论：①心肌组织CaMKⅡ基因正常表达对于维持增龄果蝇心脏功能、运动能力、生命周期十分重要，心肌组织CaMKⅡ基因长期低表达加速了心脏功能和运动能力的增龄衰退，同时果蝇生命周期缩短。②3周规律运动显著延缓了果蝇心脏泵血能力的增龄下降，同时延长了果蝇晚间睡眠时间，提示运动适应效应同样适用果蝇。③3周规律运动可能通过心肌细胞CaMKⅡ通路途径介导心肌肌力作用，影响果蝇心肌泵血能力。

目录

摘要

1 前言

2 材料与方法

2．1 果蝇品系及培养

2．2 实验方案

2．2．1 果蝇杂交及分组方案

2．2．2 果蝇运动训练方案

2．3 实验方法

2．3．1 同源基因查找及基因保守性分析

2．3．2 实时定量荧光PCR检测

2．3．3 心脏功能检测

2．3．4 活动节律检测

2．3．5 攀爬能力检测

2．3．6 生命周期检测

2．4 主要仪器，试剂与器具

2．4．1 主要仪器

2．4．2 主要试剂

2．4．3 主要实验器具

2．5 质量控制

2．5．1 果蝇饲养质量控制

2．5．2 运动训练质量控制

2．5．3 果蝇麻醉剂量的控制

2．6 统计分析

2．6．1 心脏功能相关指标数据统计分析

2．6．2 活动节律数据统计分析

2．6．3 攀爬能力数据统计分析

2．6．4 生命周期数据统计分析

3 结果

3．1 黑腹果蝇CaMKⅡ基因与其人类同源基因CaMKⅡδ功能保守性分析结果

3．2 qRT-PCR检测结果

3．3 心脏功能检测结果

3．3．1 增龄对果蝇心脏功能的影响

3．3．2 心肌或全身组织CaMKⅡ基因敲减对增龄果蝇心脏功能的影响

3．3．2 运动对不同基因型果蝇心脏功能的影响

3．4 活动节律监测结果

3．5 攀爬能力检测结果

3．6 生命周期检测结果

4 分析与讨论

4．1 果蝇CaMKⅡ基因与人类同源基因功能保守性分析

4．2 运动对增龄果蝇心脏功能的影响

4．3 心肌组织CaMKⅡ基因敲减对增龄果蝇心脏功能的影响

4．4 心肌组织CaMKⅡ基因敲减对增龄果蝇心脏功能运动适应效应的影响

4．5 运动或心肌组织CaMKⅡ基因敲减对增龄果蝇睡眠-觉醒节律的影响

4．6 运动或心肌组织CaMKⅡ基因敲减对增龄果蝇攀爬能力的影响

4．7 运动或心肌组织CaMKⅡ基因敲减对增龄果蝇生命周期的影响

5 结论

参考文献

心肌CaMKII与心脏功能衰退研究进展(综述)

缩略词表

科研情况

致谢

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