海洋微生物生物活性菌株的筛选及菌株01299次级代谢产物的研究

摘要

目的:本文选取自中国南海及印度洋深海沉积物中分离鉴定的放线菌为研究对象，通过高通量发酵及活性和化学筛选，发现代谢产物丰富，抑菌活性良好的目标菌株。结合不同模式的活性检测，对目标菌株进行进一步发酵、提取、分离和纯化其次级代谢产物，利用NMR、MS等现代波谱技术分析其分子结构，阐明目标微生物的活性来源，为开发和利用新的药用微生物资源提供理论依据。方法:①中科院海洋微生物研究中心微生物库选取的26株放线菌进行高通量发酵，以薄层色谱法(TLC)和高效液棚色谱法(HPLC)确定次级代谢产物丰富的菌株;以抑菌试验为活性导向初步筛选出有活性的菌株;②将筛选出的目标菌株进行发酵，将粗浸膏依次以常压柱层析（正相硅胶、反相Rp-18硅胶）、中压制备色谱(MPLC)以及制备型高效液相色谱法(HPLC)分离纯化;③用MS、NMR等现代光谱学方法鉴定单体化合物的结构;④测定单体化合物的抑菌活性、1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH·)自由基清除活性和血管紧张素转化酶抑制活性。结果:菌株的生物活性筛选发现放线菌Pseudonocardia sp.SCSIO01299能产生丰富且有活性的次级代谢产物，将其确定为目标菌株，进行次级代谢产物的分离纯化和结构鉴定，共分离鉴定13个化合物，其中五个环二肽类:环（L-脯-L-酪）二肽(1)、环（L-脯-L-缬）二肽(2)、环（L-脯-L-苯丙）二肽(3)、环（L-缬-L-苯丙）二肽(4)、环（L-脯-L-亮）二肽(5);一个二氮蒽醌类:Deoxynyboquinone(6);一个酯类:邻苯二甲酸二乙二醇酯(7);三个酸类:十四碳烷酸（豆蔻酸）(8)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸（香草酸）(9)、3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸（丁香酸）(10);一个醇类:吐叶醇(11)和两个苯并恶唑啉酮类:6-羟基-2-苯并恶唑啉酮(12)、2-苯并恶唑啉酮(13)。化合物1～10的活性测试表明，化合物3和5具有1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH·)自由基清除活性，IC50值分别为:9.48μmol·mL-1和2.85μmol·mL-1;化合物4具有血管紧张素转化酶抑制活性，IC50值为0.72μmol·mL-1;化合物6对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌有抑制作用，最小抑菌浓度分别为:0.025mmol·L-1，0.05mmol·L-1，0.05mmol·L-1。结论:本研究对海洋来源放线菌的次级代谢产物及其活性进行探索，发现了两株具有丰富代谢产物和良好活性的菌株，并以菌株01299为对象分离的单体化合物显示较好的活性，为这个菌株的迸一步开发利用提供了科学理论基础。

目录

摘要

1 引言

1．1 研究背景

1．2 本论文的研究目的和意义

1．3 主要研究内容

1．4 技术路线

2 26株海洋放线菌的活性筛选和目标菌株的确定

2．1 菌株的发酵与次级代谢产物的提取

2．1．1 样品来源

2．1．2 菌株的活化与发酵

2．1．3 次级代谢产物的提取

2．2 菌株的筛选模型

2．2．1 筛选方法

2．2．2 抑菌活性筛选

2．2．3 化学筛选

2．3 目标菌株的确定和发酵条件优化

2．3．1 培养基选择试验

2．3．2 培养方式选择试验

2．3．3 发酵时间的考察

2．4 结果与分析

2．4．1 菌株抑菌活性筛选结果

2．4．2 TLC筛选结果

2．4．3 HPLC筛选结果

2．4．4 目标菌株的确定

2．5 小结与讨论

3 放线菌01299菌株的化学成分研究

3．1 材料和方法

3．1．1 仪器和试剂

3．1．2 菌株来源及保藏

3．1．3 菌株的发酵和萃取

3．1．4 分离纯化

3．1．5 结构鉴定

3．2 结果与讨论

3．3 化合物波谱数据

3．4 小结与讨论

4 次级代谢产物生物活性的研究

4．1 抑菌活性试验

4．1．1 试剂和仪器

4．1．2 测定方法

4．2 自由基清除活性试验

4．2．1 原理

4．2．2 试剂和仪器

4．2．3 测定方法

4．3 血管紧张素转化酶抑制活性实验

4．3．1 原理

4．3．2 试剂和仪器

4．3．3 试剂的配制

4．3．4 试验方法

4．4 结果与讨论

4．4．1 抑菌活性

4．4．2 (DPPH·)自由基清除活性

4．4．3 血管紧张素转化酶抑制活性

4．5 小结与讨论

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

综述 海洋放线菌次级代谢产物研究概况

攻读硕士学位期间发表的论文

致谢

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