内含特定PIK3CA基因突变检测质控物的研制及其应用的研究

摘要

目的:研制内含特定PIK3CA突变基因并可模拟真实临床样本的质控物，在临床实验室将其用在基因突变检测室间质量评价预研活动中，讨论该质控物的实用性和各临床实验室检测PIK3CA基因突变的能力。
　　方法:人工制备含有5种不同PIK3CA基因型人乳腺癌细胞系和人结直肠癌细胞系的甲醛固定石蜡包埋样本，依次用4％中性甲醛溶液固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明及石蜡包埋后再次包埋切片;通过HE染色直接评价切片细胞含量;每100支初步质控物中抽取6支样本进行DNA提取并进行浓度测定，并将制备好的质控物分别放置在37℃、室温(20～25℃)和2～8℃进行稳定性测试;PCR-Sanger测序和扩增阻碍突变系统法对不同基因型进行验证后，组成PIK3CA基因突变室间质量评价预研样本盘发放至各临床实验室，同时将样本盘送往三家国内权威实验室进行检测;统计分析各实验室回报结果。
　　结果:切片细胞含量足够，分布均匀，每支样本DNA浓度均大于500 ng，在37℃、室温(20～25℃)和2～8℃条件下可以稳定保存至少6个月;PCR-Sanger测序和扩增阻碍突变系统法对不同基因型进行验证结果与预期相符;对各实验室回报的结果进行统计分析显示，2015年PIK3CA室间质评预研收到75份有效回报结果。检测结果完全正确实验室比例为25.33％(19/75)，所有参评实验室检测的假阴性率为18.67％(112/600)，假阳性率为17.33％(26/150)。所有参评实验室检测的阳性样本符合率为62.83％(377/600)，阴性样本符合率分别为79.33％(119/150)。使用最多的检测方法是扩增阻滞突变系统法（ARMS）方法。
　　结论:本研究成功建立了人工制备内含特定PIK3CA基因突变检测质控物的方法并应用于室间质量评价预研;研制的质控物比临床病理样本来源广，更稳定，异质性小，容易大量制备，可有效用于PIK3CA基因突变检测室间质量评价;2015年室间质量评价预研结果显示，各实验室在样本总体符合率上不高，假阳性率和假阴性率一直是影响突变检测正确率的主要因素。

目录

摘要

英文摘要

引言

材料和方法

1．实验材料和试剂配制

2．方法

2．1．PIK3CA基因突变细胞系的复苏及培养

2．2．PIK3CA基因突变细胞系基因型的验证

2．3．PIK3CA基因突变检测室间质评样本的制备及验证

2．4．PIK3CA基因突变检测室间质评样本均匀性和稳定性验证

2．5．PIK3CA基因突变检测室间质评样本盘的构建

2．6．PIK3CA基因突变检测室间质量评价预研

结果

2．1．含有PIK3CA基因突变细胞系的培养

2．2．PIK3CA基因突变细胞系基因型的验证

2．3．PIK3CA基因突变检测室间质评样本基因型的验证及样本盘的构建

2．4．PIK3CA基因突变检测室间质评样本均匀性和稳定性验证

2．5．PIK3CA基因突变检测室间质评预研回报结果统计分析

讨论

结论

参考文献

文献综述

缩略词表

附录

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致谢

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