PMK-2信号途径介导秀丽小杆线虫对苏云金芽胞杆菌Cry6A晶体蛋白防御反应的研究

摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)产生的伴胞晶体蛋白具有很好的杀虫效果，并且作为生物农药得到了广泛的应用。目前报道的对线虫具有活性的Bt晶体蛋白有很多，最典型的有Cry5B和Cry6A两大类。Cry6A是一种结构非常独特的杀虫伴胞晶体蛋白，它与Cry5B及其他的伴胞晶体蛋白在结构上有很大的差异，亲缘关系较远。并且Cry6A没有Cry5亚家族中的三个保守结构域。已有研究初步证明Cry5B与Cry6A具有不同的杀虫机制。因此，Cry6A在解决昆虫对晶体蛋白的抗性问题方面具有很大的优势，是一种非常具有应用前景的杀虫晶体蛋白。
　　本研究以模式生物秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）为材料，探索线虫通过信号转导途径对Cry6A晶体蛋白毒素的防御反应。秀丽小杆线虫体内存在3个p38 MAPK异构体PMK-1、PMK-2、PMK-3，pmk-1、pmk-2、pmk-3、这三个基因位于线虫IV号染色体上，组成一个操纵子，共用一个启动子。并且PMK-1和PMK-2氨基酸序列的同源性高达62％。在秀丽小杆线虫肠细胞中PMK-1调控先天免疫，能被TIR-1-NSY-1-SEK-1信号通路所激活，而PMK-2由于受miR-58家族的干扰，在肠细胞中的表达被高度抑制，主要在神经系统中表达。尽管PMK-1、PMK-2具有高度的同源性，但两者可能是功能截然不同的蛋白。我们的前期通过蛋白质组学分析发现，Cry6A毒素蛋白能够使秀丽小杆线虫体内的PMK-2蛋白表达水平显著上调，因此我们推测PMK-2可能参与了秀丽小杆线虫对Cry6A晶体蛋白的防御反应。
　　PMK-1能被上游激酶NSY-1（一种MAPKK）和SEK-1(一种MAPKK)所激活，而pmk-1和pmk-2位于同一个操纵子上，因此我们推测PMK-2也能被NSY-1和SEK-1所激活。
　　我们的实验表明:1、Cry6A晶体蛋白毒素作用秀丽小杆线虫能显著提高pmk-2基因转录水平;2、通过RNAi技术沉默秀丽小杆线虫pmk-2基因，线虫对Cry6A晶体蛋白毒素敏感性显著增强;3、通过western blot实验检测证明Cry6A晶体蛋白毒素能诱导线虫体内PMK-1和PMK-2发生磷酸化，从而激活PMK信号途径。4、检测PMK上游两个激酶NSY-1和SEK-1突变体对Cry6A毒素敏感性发现，相对于野生型线虫突变体对Cry6A的敏感性显著增强，且Cry6A毒素不能诱导两个突变体中PMK-2发生磷酸化。此结果表明，PMK-2与PMK-1一样，是通过上游NSY-1和SEK-1发生磷酸化级联反应激活的。本研究结果充分证明PMK-2介导了秀丽小杆线虫对Cry6A晶体蛋白毒素抗性。

目录

摘要

第一章 绪论

1 秀丽小杆线虫简介

1．1 秀丽小杆线虫的生物学特征

1．2 秀丽小杆线由作为模式生物的优势

2 秀丽隐杆线虫先天免疫信号转导途径

2．1 MAPK信号转导通路

2．2 DAF-2信号转导通路

2．3 TGF-β信号转导通路

2．4 PCD信号转导通路

3 苏云金芽孢杆菌杀虫机制研究

3．1 苏云金芽孢杆菌的生物学特征及活性物质

3．2 苏云金芽孢杆菌的杀虫机制

3．3 Cry6A与Cry5B结构及作用方式的差异

4 RNA干扰技术的作用机制及应用

5 立题依据及意义

第二章 材料与方法

1 材料

1．1 供试菌株及秀丽小杆线虫

1．2 载体

1．3 培养基

1．4 抗生素

1．5 抗体

1．6 PCR引物合成

1．7 主要试剂和试剂盒

1．8 相关溶液配制

1．9 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 Cry6A对秀丽小杆线虫pmk-1、pmk-2、pmk-3 mRNA转录水平的影响

2．2 Cry6A对秀丽小杆线虫不同突变体PMK-1、PMK-2蛋白磷酸化水平的影响

2．3 秀丽小杆线虫pmk-2基因的RNA干扰

2．4 Cry6A对pmk-2基因干扰后秀丽小杆线虫半致浓度测定实验

2．5 Cry6A对秀丽小杆线虫pmk-2、sek-1、nsy-1线虫突变体LC50的测定

2．6 秀丽小杆线虫PMK-1、PMK-2蛋白的原核表达

第三章 结果与分析

1 Cry6A对秀小杆线虫pmk-1、pmk-2、pmk-3基因转录水平的影响

1．1 Cry6A蛋白的诱导表达

1．2 秀丽小杆线虫总RNA的提取

1．3 qRT-PCR检测Cry6A毒素对秀丽小杆线虫PMK-2蛋白转录水平的影响

2 Cry6A对秀丽小杆线虫PMK-1、PMK-2蛋白磷酸化水平的影响

2．1 Cry6A对秀丽小杆线虫N2 PMK-2蛋白磷酸化水平的影响

2．2 PMK-2上游激酶的检测

3 秀丽小杆线虫pmk-2基因的RNA干扰

3．1 pmk-2基因的RNA干扰载体的构建

3．2 pmk-2基因干扰载体菌株喂食线虫

3．3 pmk-2基因干扰效果检测

4 Cry6A对pmk-2基因干扰后秀丽小杆线虫半致死浓度测定

4．1 Cry6A晶体蛋白的提取纯化

4．2 Cry6A晶体蛋白对野生型N2及pmk-2基因沉默秀丽小杆线虫的毒力作用

5 秀丽小杆线虫PMK-1、PMK-2蛋白的原核表达

5．1 重组质粒pET28a-pmk-1、pRSETA-pmk-2的构建

5．2 PMK-1和PMK-2蛋白的诱导表达

5．3 PMK-1和PMK-2蛋白质谱分析

第四章 讨论

秀丽小杆线虫对Cry6A的防御反应

第五章 结论

1 Cry6A能诱导pmk-2 mRNA转录水平的上升

2 Cry6A能激活PMK-1和PMK-2蛋白发生磷酸化

3 pmk-2基因沉默后的秀丽小杆线虫对Cry6A的敏感性增强

4 SEK-1和NSY-1是PMK-2蛋白参与秀丽小杆线虫防御Cry6A毒素蛋白的上游激酶

参考文献

攻读硕士学位期间撰写和发表的论文专利

课题受资助的基金项目

致谢

声明