Mab21家族蛋白在晶状体上皮细胞中的功能及其机制研究

摘要

眼睛是人类观察外部世界的心灵窗户。从外面来的光线通过角膜折射进入晶状体，经过晶状体聚焦到光感受器视网膜上，从而把光信号转变成为电信号，经视网膜节后神经元传入大脑中枢神经，形成清晰的影象。在这个光传导系统中晶状体起着十分重要的的作用。晶状体病变导致世界首要致盲疾病白内障。因此，深入了解眼睛晶状体的发育机制，探讨防止白内障发生是关系到人类健康福祉的重大科学问题。晶状体的发育由前脑的外胚层而来。在视泡的诱导下其上的外胚层内陷形成晶体泡。一旦晶体泡形成，后部的上皮细胞开始分化形成晶状体的初级纤维，充满晶体泡空间。其后晶状体前部的上皮细胞在亚赤道区域进入分裂，其中一个转移至赤道区，进入分化形成次级纤维，而另一个而留下进行有限的分裂。而晶状体前部中央区的体干细胞则不断补充亚赤道区的分裂细胞。完成晶状体的不断生长，产生次级纤维。
　　晶状体的发育是由一系列的转录因子不断表达，并通过与邻近组织相互作用来完成自身的形态发生。首先控制大脑和眼睛发育的关键基因Pax6的表达和功能奠定晶体板和晶体泡的形成，随后一系列其他转录因子开始被激活，完成晶状体初级和次级纤维分化的功能。Mab21L1和Mab21L2是在Pax6下游控制眼睛发育的两个重要转录因子。小鼠基因敲除实验表明Mab21L1对晶状体的发育至关重要，而Mab21L2而与视网膜发育密切相关，这两个基因的敲除都会导致小鼠胚胎眼睛缺陷。甚至纯合子敲除Mab21L2基因对小鼠来说是致死的，Mab21L1的敲除也会导致雄性小鼠不育。然而在细胞水平，这些基因的功能究竟是什么则有待深入研究。
　　本论文通过建立稳定过表达Mab21L1和Mab21L2的小鼠晶体上皮细胞系作为检测系统，对二者在晶体上皮细胞生长分化，应激与凋亡及凋亡复原的功能进行认真的分析，取得了如下结果:首先，Mab21L1和Mab21L2的表达促进晶体上皮细胞从细胞分裂周期退出进入细胞分化。其分子特征是β-晶体蛋白的表达，不仅如此，它上游的控制转录因子HSF4和C-Maf也因着Mab21L1和Mab21L2的过表达而明显升高，由此似乎可以总结出Mab21家族蛋白可能上调HSF4和C-Maf的表达而导致β-晶体蛋白表达的上升，促使上皮细胞分化。除此之外，在应激因子冈畸酸（蛋白磷酸酶抑制剂）处理下，Mab21L1和Mab21L2转化的晶体上皮细胞比空载体转化的对照细胞有更强的抗凋亡能力。进一步的分子机制分析表明Mab21L1和Mab21L2能上调抗凋亡基因Mcl-1的表达而下调促凋亡因子BCL-XLS/L和Bak的表达。通过在空载体转化的细胞中敲除Bak或过表达Mcl-1证明，Bak和Mcl-1二者表达的变化的确与小鼠晶体细胞的活性密切相关。这些结果表明Mab21L1和Mab21L2可能直接调节上述与凋亡相关的基因表达而增强晶体上皮的应激能力。
　　再者，本论文首次探讨了Mab21L1和Mab21L2晶体上皮细胞在经历凋亡损伤后对细胞复原的功能。结果表明只有Mab21L1转化的细胞能使凋亡启动的细胞进入复原。综上所述本论文阐明了Mab21L1和Mab21L2基因通过调节多个不同下游基因的表达而促进分化和增强抗凋亡的能力。并首次阐明二者能促进细胞经历应激损伤后的复原。
　　这些结果为了解Mab21L1和Mab21L2的功能机制带来新的信息。

目录

摘要

第一章 前言

1．眼睛的结构

2．晶状体

2．1 晶状体的结构

2．2 晶状体的发育过程

2．3 分子机制和调节

2．4 晶状体上皮细胞的分化

2．5 FGF(成纤维细胞生长因子)

3．Mab-21基因家族

3．1 Mab21基因的结构

3．2 Mab21L1对正常晶状体的发育的重要性

3．3 Mab21L1基因与其它基因之间的关系

3．4 Mab-21基因和其它调控因子之间的相互作用，以及TGF β和JNK信号通路对其功能的调控作用

3．5 Mab21基因的突变和疾病

4 细胞凋亡

4．1 细胞凋亡与细胞坏死的区别

4．2 细胞凋亡途径的分类

4．3 细胞凋亡的检测

5 复原(anastasis)

第二章 稳定过表达Mab21L1和Mab21L2细胞系的建立

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 化学试剂

2 实验方法

2．1 CaCl2法感受态细胞的制备

2．2 DH5 α大肠杆菌的热击转化

2．3 碱裂解法小提质粒

2．4 大提质粒

2．5 质粒DNA的提纯

2．6 α TN4-1细胞的培养

2．7 质粒DNA转染细胞

2．8 单克隆细胞的筛选

2．9 Western blot

3．实验结果

3．1 Mab21L1和Mab21L2质粒的来源

3．2 利用小鼠晶状体上皮细胞α TN4-1，建立稳定表达Mab21L1和Mab21L2及空载体的稳定细胞株

3．3 α-TN4和不同转化稳定细胞株的形态学分析

第三章 Mab21L1和Mab21L2对细胞生长，分化的调节功能及其机制

1 实验材料、实验仪器及化学试剂

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

1．3 实验试剂

2 实验方法

2．1 细胞计数方法计算细胞生长曲线

2．2 western blot

2．3 b-FGF诱导细胞的分化

3．1 Mab21L1和Mab21L2基因的过表达抑制细胞的生长

3．2 Mab21L1和Mab21L2过表达促进细胞分化

第四章 Mab21L1和Uab21L2对晶状体上皮细胞应激条件下活性的调节及其机制

1 实验材料、实验仪器及化学试剂

1．1 实验材料

1．2 实验器材

1．3 实验试剂

2 实验方法

2．1 Hotchst染色

2．4 lipofecta分钟e 3000过表达Mcl-1

3．实验结果

第五章 Mab21L1能调节对晶状体上皮细胞经历应激条件启动的凋亡后进入复原

1 实验材料、实验仪器及化学试剂

1．1 实验材料

1．2 实验器材

1．3 实验试剂

2 实验步骤

2．1 细胞的处理

2．2 Western blot

3．实验结果

1．总结

2．讨论及研究展望

2．1 Mab21L1和Mab21L2促进晶状体上皮细胞从细胞分裂周期进入细胞分化

2．2 Mab21L1和Mab21L2对应激条件下应激条件下活性的调节及其机制

2．3 Mab21L1能调节对晶状体上皮细胞经历应激条件启动的凋亡后进入复原

参考文献

附录

博士学习期间撰写、发表的主要论文及获奖情况

致谢

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