大孢粘球菌STXZ54的抗肿瘤活性代谢产物研究

摘要

粘细菌(Myxobacteria)是一类革兰阴性长杆状细菌，栖息于土壤，分布广泛。粘细菌在其生长过程中能够产生极其丰富的抗菌、抗肿瘤活性的次生代谢产物，如已经用于临床癌症治疗的埃博霉素等。粘细菌在微生物天然药物前体物质的开发研究方面具有重要地位。
　　本研究中，利用本实验室从土壤中筛选出的大孢粘球菌Myxococcus macrosporus新菌株STXZ54(保藏号CCTCC NO:M2014455)发酵后，将发酵上清液于不同温度下处理后作用肿瘤细胞，随后观察抗肿瘤活性的差异。实验结果表明高温与低温作用后的发酵上清液对肿瘤细胞的毒力并没有显示出差异，推测发酵上清液中的主要活性物质具很强的热耐受性。
　　DM-301树脂吸附发酵上清液中的主要活性物质，利用HPLC对树脂吸附的抗肿瘤活性粗提物进行精细分离，得到4种高抗肿瘤活性组分，分别命名为CS1、CS2、CS3、CS4。利用LC-MS/MS分析得出这些活性物质的质荷比依次为182.97 m/z、175.01m/z、254.33m/z、305.09m/z，其中活性组分CS3显示出良好的抗肿瘤效果。CCK-8法测定了CS3对B16、Hela、Hep-3B、SMMC-7721、SW480等肿瘤细胞的半致死浓度(IC50)，其数值均在7.68-32.34μg/mL之间。CS3对HUVEC细胞即人脐带内皮细胞并无明显毒性作用，其半致死浓度值为66.27μg/mL，显示出活性组分CS3抗肿瘤活性物质可能具有潜在的临床应用价值。
　　利用激光共聚焦显微镜、扫描电镜等观察到活性组分CS3能够显著损坏肿瘤细胞形态并使之凋亡。与对照组相比，CS3作用后的肿瘤细胞萎缩变圆，微管蛋白降解引起肿瘤细胞骨架坍塌解体，甚至发生消融。用“伤口愈合”实验检测肿瘤细胞的迁移能力变化，发现CS3对SMMC-7721和B16肿瘤细胞的迁移运动有显著的抑制作用，能有效抑制肿瘤细胞向四周扩散。
　　在MD1培养基中分别添加10μM的Cu2+、Fe3+、Ba2+、Mn2+和Zn2+、葡萄糖来优化STXZ54的营养条件，以提高抗肿瘤活性物的产量。结果表明，在MD1培养基中添加10μM的Cu2+或葡萄糖时，STXZ54发酵上清液对肿瘤细胞的毒性效果显著增强。
　　本文创建了Myxococcus macrosporus STXZ54抗肿瘤活性物质CS3的分离方法，初步分析了CS3对Hela、SMMC-7721、B16等肿瘤细胞的活性表现。利用添加葡萄糖与微量元素的方法优化了STXZ54的发酵培养条件，显著提高了抗肿瘤活性物质的产量。上述研究丰富了粘细菌产生功能活性产物的基因簇资源，为粘细菌抗肿瘤新药物前体物质的发现及应用奠定了重要的基础。

目录

摘要

1．1 粘细菌的概述

1．1．1 粘细菌的发现

1．1．2 粘细菌的形态特征

1．1．3 粘细菌的分类

1．1．4 粘细菌的分布与生存环境

1．1．5 粘细菌的生活周期

1．1．6 粘细菌的基因组

1．1．7 粘细菌的运动

1．1．8 粘细菌的研究进展

1．2 粘细菌天然活性代谢产物的研究

1．2．1 粘细菌天然活性代谢产物的特点

1．2．2 粘细菌活性产物的作用机制

1．2．3 粘细菌抑菌活性代谢产物

1．2．4 粘细菌抗肿瘤活性代谢产物

1．3 粘细菌的应用价值

1．3．1 粘细菌应用于农业发展

1．3．2 粘细菌应用于工业生产

1．3．3 粘细菌应用于医药卫生

1．4 本研究的目的与意义

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 供试细胞名称与来源

2．1．3 粘细菌培养基

2．1．4 试剂

2．2 实验方法

2．2．1 菌种培养及保藏

2．2．2 菌株的形态观察

2．2．3 抗肿瘤活性的初步研究

2．2．4 STXZ54菌株抗肿瘤活性物质的分离

2．2．5 抗肿瘤活性物质的活性检测

2．2．6 微量金属离子及葡萄糖对STXZ54抗肿瘤活性的影响

3．1 STXZ54的菌株形态观察

3．2 STXZ54发酵上清液的抗肿瘤活性

3．3 不同温度下发酵上清液的抗肿瘤活性

3．4 STXZ54在不同生长时期的抗肿瘤活性

3．5 抗肿瘤小分子物质的分离

3．5．1 抗肿瘤活性物质的粗分离

3．5．2 抗肿瘤活性物质的精细分离

3．5．3 抗肿瘤活性物质的等吸收光谱图

3．5．4 抗肿瘤活性物质的质谱鉴定

3．6 CS3的抗肿瘤毒性分析

3．6．1 CS3的抗肿瘤谱

3．6．2 激光共聚焦显微镜观察肿瘤细胞亚细胞形态的变化

3．6．3 扫描电子显微镜观察细胞形态变化

3．6．4 倒置显微镜观察细胞形态变化

3．6．5 台盼蓝染色检测CS3对肿瘤细胞的毒性作用

3．6．6 抑制肿瘤细胞迁移实验

3．7 Cu2+及葡萄糖对STXZ54抗肿瘤活性物质产量的影响

3．7．1 Cu2+及葡萄糖对STXZ54菌株的生长情况及抗肿瘤活性的影响

3．7．2 Cu2+、葡萄糖的最适浓度

3．7．3 Cu2+和葡萄糖对CS3抗肿瘤活性的影响

3．7．4 Cu2+及葡萄糖对STXZ54菌体形态的影响

3．7．5 UHPLC对STXZ54菌株产CS3产量的检测

3．7．6 SDS-PAGE检测STXZ54菌体蛋白及分泌蛋白差异

4 讨论

5 结论

参考文献

缩略表

论文发表情况

项目资助情况

致谢

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