人嗅黏膜间充质干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究

摘要

目的：
　　探讨人嗅黏膜间充质干细胞体外诱导分化为血管内皮细胞的能力，并对分化后血管内皮细胞进行鉴定。
　　方法：
　　1.人嗅黏膜间充质干细胞的培养及鉴定:在鼻内镜下夹取正常鼻黏膜组织，采用组织贴壁法培养嗅黏膜间充质干细胞;利用流式细胞仪检测细胞的表面标记物对培养的细胞进行鉴定。
　　2.诱导人嗅黏膜间充质干细胞分化为血管内皮细胞:取P3代人嗅黏膜间充质干细胞，以1×109/L接种于含2％胎牛血清的L-DMEM培养基的6孔板或培养瓶中，当细胞达到90％融合时，随机分为2组:诱导组加入含50 ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF)的培养基，对照组不加入血管内皮细胞生长因子，分别置37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度恒温培养箱培养。
　　3.血管内皮细胞的鉴定:
　　(1)倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化。
　　(2)免疫荧光染色:诱导12天后，免疫荧光染色检测CD31、CD34、vWF在诱导组与对照组细胞中的表达。
　　(3) RT-qPCR:提取诱导组与对照组细胞的RNA，荧光定量检测Flt-1，vWF，Flk-1在细胞中的表达。
　　(4)细胞表型:利用流式细胞仪检测血管内皮细胞特异性的表面标记物CD31和vWF的表达。
　　(5) NO分泌量的检测:诱导12天后分别取诱导组与对照组的细胞上清液，按照NO检测试剂盒的说明书进行操作，测得样品OD值，代入公式计算NO浓度。
　　(6)体外血管形成实验:将细胞接种到铺有Matrix的培养板中，观察在基质胶上细胞形成毛细血管样网状结构的能力。
　　结果：
　　1.培养的细胞贴壁生长，阳性表达CD73、CD90、CD105，阴性表达CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR，符合间充质干细胞的鉴定标准，且细胞纯度达到95％以上。
　　2.血管内皮细胞鉴定:
　　(1)形态学观察:诱导后，细胞体积变小，细胞形态由长梭形逐渐变为短梭形、形态逐渐饱满，立体感增强。
　　(2)免疫荧光:诱导后的细胞CD31、CD34、vWF染色阳性。
　　(3) RT-qPCR:诱导后的细胞中Flt-1，vWF，Flk-1表达明显增高，具有统计学意义。
　　(4)细胞表型:诱导后的细胞CD31与vWF表达阳性，比例约30％左右。
　　(5) NO分泌量:诱导组培养细胞的上清液中的NO含量高于对照组，差异有统计学意义。
　　(6)体外血管形成:诱导组细胞接种于基质胶后，形成管样结构，管样结构连接成网。而对照组细胞接种于基质胶后，未形成管样结构。
　　结论：
　　1.人嗅黏膜组织块贴壁培养法可培养出嗅黏膜间充质干细胞。
　　2.血管内皮细胞生长因子(VEGF)可诱导人嗅黏膜间充质干细胞分化为血管内皮细胞。
　　3.诱导分化后的血管内皮细胞是具有功能的血管内皮细胞，在体外可形成管样结构。

目录

摘要

引言

第一章 材料

1．人嗅黏膜组织的来源

2．实验所用主要试剂

3．主要实验仪器

4．细胞培养液及试剂的配制

第二章 方法

1．人嗅黏膜的获取

2．人嗅黏膜间充质干细胞的培养

3．人嗅黏膜间充质干细胞的传代

4．人嗅黏膜间充质干细胞的冻存

5．人嗅黏膜间充质干细胞的冻存后的复苏

6．流式细胞仪检测人嗅黏膜间充质干细胞表面标记物

7．诱导人嗅黏膜间充质干细胞分化为血管内皮细胞

8．诱导分化后细胞(VECs)的鉴定

9．统计学分析

第三章 结果

1人嗅黏膜的获取

2．人嗅黏膜间充质干细胞的形态学特征

3人嗅黏膜间充质干细胞的细胞表面标记物

4．诱导分化后细胞(VECs)的形态学特征

5．诱导分化后细胞(VECs)的免疫荧光染色结果

6．诱导分化后细胞(VECs)RT-qPCR结果

7．诱导分化后细胞(VECs)的细胞表型分析

8．诱导分化后细胞(VECs)的NO分泌量的检测结果

9．诱导分化后细胞(VECs)的体外血管形成

第四章 讨论

1．嗅黏膜间充质干细胞(OM-MSCs)的特性

2．诱导嗅黏膜间充质干细胞(OM-MSCs)向血管内皮细胞分化(VECs)及相关研究结果

第五章 结论

参考文献

综述

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致谢

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