基于NF--κB通路研究有氧运动与黑枸黄酮对酒精性肝损伤小鼠的干预及组织差异表达

摘要

研究目的:近年来，酒精性肝病(ALD)备受关注。现今，针对酒精性肝损伤的治疗仍未得到较好的解决，为此深入研究酒精致肝损伤的产生及其发展机制，寻找有效的预防和治疗手段是对该类患者临床治疗的关键。本研究旨在通过酒精性肝损伤小鼠造模和相关因素的刺激，研究有氧运动与黑果枸杞黄酮对酒精性肝损伤的影响效果，并在此基础上，对小鼠的肝和血液组织中NF-κB通路及其相关因子的基因表达谱进行了分析，探讨有氧运动与黑枸黄酮对小鼠酒精致肝损伤的干预效果及其相关炎症机制。 研究方法:50只健康昆明种小鼠，雄性且SPF级，经口灌胃方法构建酒精致肝损伤的模型。正常组灌胃等体积蒸馏水;对造模后的实验小鼠随机分组法分为模型组、黑枸黄酮组、有氧运动组和有氧运动联合黑枸黄酮干预组。各干预组于建模成功后第3天，每日固定时间点开始进行有氧运动和黑枸黄酮灌胃干预，其中小鼠有氧运动的方式采用跑台训练，进行0坡度中等强度的有氧运动;黑枸黄酮干预每日定时采用经口灌胃浓度为200mg/kg，进行灌胃1次。所有干预措施每周6次，共6周。实验干预时期，对各组小鼠进行一般行为学观察。实验完成后，所有小鼠禁食过夜处理，称重后麻醉动物并处死，分离出肝组织并进行称重。采用HE染色对小鼠肝组织进行显微结构形态学观察、组织病理评分;免疫组化法对小鼠肝组织NF-κB、TNF-α、IL-6细胞因子蛋白表达进行检测;实时荧光定量-PCR技术对小鼠肝脏组织和血液组织中NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-10的基因表达进行检测;血生化检验ALT、AST和TBIL含量。 研究结果:(1)血清学结果显示:正常组、黑枸黄酮组、有氧运动联合黑枸黄酮组血清种ALT、AST、TBIL含量比模型组低，呈非常显著性差异(P＜0.01)，有氧运动组中三者的含量也成下降趋势(P＜0.05)。(2)HE染色及病理组织学评分显示，病理改变主要为肝细胞脂肪变性，与模型组对比，各干预组的脂肪变性评分均有统计学意义(P＜0.01)。正常组小鼠肝细胞结构完整。模型小鼠肝索结构紊乱、小叶结构严重破坏、胞质疏松且有脂肪空泡大小不一，并伴随炎性细胞浸润;有氧运动组、黑枸黄酮组的小鼠肝组织破坏有不同程度的改善、炎症细胞减少;有氧运动联合黑枸黄酮干预组小鼠肝组织的小叶构造几近完整，肝细胞坏死情况和脂肪蓄积得以缓解，炎性细胞的浸润程度分明呈现较快下降(P＜0.01)。(3)免疫组织化学结果显示:模型小鼠肝组织的NF-κB、TNF-α、IL-6的阳性表达最高;有氧运动组、黑枸黄酮组、运动+黄酮组同模型小鼠相比，均具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。(4)实时荧光定量PCR检测的结果，与模型小鼠相比，三个干预组中炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-10基因表达（前期课题组实验中，RNA-seq技术显现差异性）在肝组织均有不同的变化(P＜0.05，P＜0.01)，其中单纯干预组较联合干预组各炎性细胞因子的mRNA表达也具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01);血液检测TNF-α、IL-6的mRNA表达模型组最高，与有氧运动和黑枸黄酮组比有显著性差异(P＜0.05)，而有氧运动联合黑枸黄酮组中TNF-α、IL-6mRNA表达最低(P＜0.01)。(5)经由相关分析得出，TNF-α的基因表达在肝和血液组织中呈正相关趋势，且TNF-α在两者的基因表达有具有统计学意义(P＜0.01)。 研究结论:1.长期有氧运动和黑果枸杞黄酮对小鼠酒精性肝损伤有干预作用，能调节肝损伤小鼠炎性细胞因子的变化，并且其表达水平与酒精性脂肪肝的炎性过程的发生发展过程相关。其可能机制是通过NF-κB信号通路减少与TNF-α、IL-6有关的炎症因子，进一步提高IL-10抗炎细胞因子的表达量，减缓肝脏的炎性症状，增进KM小鼠对抗酒精所致的肝脏炎症损伤。2.循环RNA的检验将是一种非侵入性方法获得分子类标记物的理想方法。将血浆循环RNA检测作为酒精性肝病筛查、诊断、观察及预后监测的重要标志物，具有良好的临床应用远景。

目录

摘要

1前言

2实验材料与方法

2．1实验动物

2．2试剂

2．2．1黑果枸杞黄酮

2．2．2常规试剂

2．2．3 Realtime-PCR

2．2．4抗体

2．3主要仪器

2．4实验方法

2．4．1动物模型的构建及实验对象分组

2．4．2运动方案及给药

2．4．3小鼠日常生活状态观察

2．4．4肝系数的测定

2．4．5样品采集与处理

2．4．6肝脏病理组织学检查

2．4．7血清学生化指标检测

2．4．8免疫组织化学检测

2．4．9 Realtime-PCR检测肝组织中NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-10mRNA表达

2．4．10质量控制

2．4．11统计学分析

3实验结果

3．1一般情况

3．2小鼠肝脏系数的影响

3．3血清生化指标的测定

3．4各组小鼠肝脏病理学变化的影响

3．5各组小鼠肝脏组织NF-κB、TNF-α、IL-6免疫组织化学染色

3．6 RT-PCR检测各组小鼠肝组织和血液NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA变化

3．6．2各组小鼠血液TNF-α、IL-6mRNA含量的变化

3．6．3各组小鼠肝组织和血液TNF-α、IL-6 mRNA水平的相关性

4讨论

4．1 KM小鼠酒精性肝损伤模型的建立

4．2酒精性肝损伤与炎症反应

4．2．1 NF-κB与肝损伤

4．2．2酒精致肝损伤后的炎症因子释放

4．3有氧运动联合黑枸黄酮对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

4．4各细胞因子mRNA在肝组织和血液表达相关分析

4．5有待进一步研究的问题

5结论

参考文献

综述 NF-κB信号通路与酒精性肝病的研究进展

缩略词表

科研情况

致谢

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