基质血管成分细胞联合点阵CO2激光对兔耳增生性瘢痕组织学改变的实验研究

摘要

目的:通过基质血管成分细胞(SVFs)联合点阵CO2激光治疗兔耳增生性瘢痕模型，观察兔耳增生性瘢痕形态学及组织学改变，分析比较不同处理情况下瘢痕中Ⅰ、Ⅲ型胶原比值变化及成纤维细胞凋亡情况，探讨基质血管成分细胞(SVFs)是否能够成功补充干细胞到瘢痕组织内以及联合点阵CO2激光是否能够更加有效地抗瘢痕增生及实现皮肤功能性修复。 方法:1、新西兰大白兔10只，制作兔耳增生性瘢痕模型，共获得增生性瘢痕模型80个，将其进行随机分组:瘢痕对照组（A组）、SVFs注射组（B组）、SVFs注射联合点阵CO2激光组（C组）、点阵CO2激光组（D组），每组20个。 2、SVFs提取及注射:造模28天后，切取的兔双侧腹股沟脂肪垫用PBS溶液反复冲洗，剔除血管，剪刀剪碎。PBS溶液反复冲洗以除去血液，加入等体积0.25％Ⅰ型胶原酶消化液37℃恒温水浴消化30min，期间需运用旋涡振荡器振荡2-3次，向离心管中加入等体积PBS溶液充分混均终止消化，200目过滤网过滤未消化完全的脂肪团块。取过滤液，1200r/min离心5min，弃上清液，PBS溶液重悬细胞，加入6倍体积红细胞裂解液，室温下孵育8-10min，1200r/min离心5min，弃上清液，得到新鲜分离的SVFs悬液。B、C两组注射SVFs悬液，A、D两组不予处理。 3、点阵CO2激光治疗(DeepFx:能量:15mJ，频率:300Hz，Shape:2，Size:8，Pulse:1，Density:5％):完成注射后，C、D两组立即予点阵CO2激光治疗，A、B两组不予处理。 4、标本的收集:观察各组兔耳增生性瘢痕的大体形态变化情况,并于治疗后第7天、14天、21天、28天、2月切取病变区组织，石蜡包埋保存。 5、评价各组效果:HE染色观察组织学变化，TUNEL检测成纤维细胞凋亡率的变化及苦味酸天狼星红染色后Ⅰ/Ⅲ型胶原比值的变化。 6、数据用SPSS21.0软件进行分析，数据为计量资料，以均数±标准差(x±s)表示，用单因素方差分析(One-way ANOVA)来比较组间均数的差异，用LSD posthoc test比较两组间的差异。P＜0.05时差异有统计学意义。 结果:1.大体观察:造模后28天，各组兔耳创面均愈合完全并形成色红、质硬、凸起的增生性瘢痕，治疗后C、D组增生性瘢痕厚度随时间逐渐变薄，质地变软，颜色接近正常皮肤。B组增生性瘢痕质地变软、色泽变淡，但厚度较C、D组厚，较A组薄。A组瘢痕仍维持明显增生状态。 2.常规病理组织学观察:HE染色后镜下观察显示增生性瘢痕真皮层增厚，其间可见丰富成纤维细胞，部分炎性细胞浸润，毛细血管增生，胶原致密，排列紊乱，旋涡状或结节状排列分布，皮肤附属器消失。经治疗后B、C、D三组增生性瘢痕均有不同程度向正常皮肤转化。A组改善不明显。 3.TUNEL检测成纤维细胞凋亡率:对照组A组瘢痕形成早期，仅有少量凋亡细胞，随时间推移凋亡细胞逐渐增加。B、C、D三组治疗后7天、14天、21天、28天，2月成纤维细胞凋亡率逐渐增高，各时期凋亡率均比同期瘢痕对照组A组高，差异有统计学意义(P＜0.05)。C、D组治疗后7天、14天、21天、28天，2月成纤维细胞凋亡率高于同期B组，差异有统计学意义(P＜0.05)，C、D两组治疗后7天、14天、21天成纤维细胞凋亡率相差不大，差异无统计学意义(P＞0.05)，而进一步对治疗后28天，2月进行比较，差异显著有统计学意义(P＜0.05)。 4.特殊染色Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值:B、C、D三组在治疗后7天、14天、21天、28天，2月Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值明显低于同期瘢痕对照组A组（P＜0.05，差异有统计学意义），且A组随胶原的不断沉积，比值逐渐增高，达到一个峰值后，趋于稳定。C、D组Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值低于同期B组，差异有统计学意义(P＜0.05)。C组在治疗后第7、14、21天Ⅰ型/Ⅲ型胶原比值低于D组，但相差不大，差异无统计学意义(P＞0.05)，进一步对治疗后28天，2个月C、D两组进行比较，差异显著有统计学意义(P＜0.05)。 结论:1.基质血管成分细胞(SVFs)联合点阵CO2激光治疗增生性瘢痕后能促进成纤维细胞凋亡，改善胶原形态、密度、排列，降低Ⅰ/Ⅲ型胶原比值以及血管的增生和炎性细胞浸润情况，疗效优于单纯点阵CO2激光及单纯基质血管成分细胞(SVFs)注射。 2.基质血管成分细胞(SVFs)注射瘢痕后可能成功补充了干细胞到瘢痕组织内，使用点阵CO2激光治疗可能更加有效刺激了脂肪来源干细胞的增殖分化，促进了皮肤的原位再生修复。

目录

摘要

第一章前言

2．1研究对象

2．2主要仪器

2．3主要试剂

2．4实验方法及步骤

2．4．1技术路线图

2．4．2兔耳增生性瘢痕模型的建立

2．4．3基质血管成分细胞(SVFs)的获取

2．4．6固定、切片

2．4．7 HE染色步骤

2．4．8 TUNEL检测步骤

2．4．9结果判定

2．4．10特殊染色步骤

2．4．11图像分析过程

2．4．12统计分析

第三章结果

3．1大体观察

3．2 HE染色观察

3．3瘢痕组织中TUNEL指标变化

3．4特殊染色结果观察

3．5图像分析

4．1增生性瘢痕

4．2基质血管成分细胞(SVFs)对瘢痕改善的意义

4．3增生性瘢痕与成纤维细胞凋亡率的相关性分析

4．4增生性瘢痕与Ⅰ／Ⅱ型胶原比值的相关性分析

第五章结论

第六章展望

参考文献

附录

综述 自体颗粒脂肪注射在瘢痕修复中的应用

致谢

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