基于连续可更新动态液滴光化学生物传感技术的研究和应用

摘要

光化学生物传感是以光学信号选择性表达检测体系化学、生物组分实时信息的应用技术。作为学科交叉与渗透的产物，它是伴随现代分析化学、有机合成技术、生物功能分子的应用、聚合物化学乃至光学波导器件、微电子技术的进步而迅速发展起来的分析化学前沿研究领域之一，它在生命科学、环境监测、疾病诊断、药物筛选、食品工业及材料科学等重要领域中正得到越来越多的应用。 光化学生物传感技术的不断发展与广泛应用，也要求它自身的各种方法与理论不断完善和创新。从化学传感的角度而言，我们希望识别分析对象的化学反应为可逆反应，以便样品浓度增加或减少时能获得连续的响应信号。在已发展的许多光化学生物传感器中，大多数识别反应都符合这一要求。但仍然有一些在分析应用上很有价值的化学反应，由于反应产物稳定性高，或者反应过程中有气体或沉淀生成等原因，使得反应完成后不能返回起始状态。这些反应往往有很高的检测灵敏度和专一性，仅仅由于不可逆性而限制了它们在光化学传感器中的应用。而且在众多的光化学传感器中，敏感材料常常被物理包埋在聚合物膜中制成敏感膜，敏感物质的流失难以避免。基于新生液滴光池的光化学生物传感技术，提供了解决这些问题的办法。这种测量装置具有连续产生新鲜试剂并与样品相互作用的功能，并且液滴本身就是无需任何光窗的光池，它避免了在传统的光化学测量中，试剂和样品对比色池的污染以及因反应池池壁对光的吸收、散射或过程中产生的吸附物质等所引起的对测量信号的干扰；液滴光池近似光学透镜的形态具有聚光作用，使收集到的透射光信号比普通流通池更多，提高了光耦合效率，因而可以大大提高传感器检测的灵敏度和准确性。 本论文在我们实验室前期开展的动态液滴光化学传感技术研究工作的基础上，充分结合现代分析技术和荧光分析手段，系统研究了液滴生长机理、光波传输与耦合效率、信号接收与重现性等涉及液滴光化学生物传感器选择性与灵敏度的技术指标问题；探讨了液滴表面更新技术及在反应体系中既可充当无光窗光池又可充当反应器的特征，从而为不可逆反应体系在光化学生物传感领域中的应用提供了新的思路和方法；通过对以光纤传导为基础的动态液滴光化学传感原理验证机的改进，发展了以F2500和LS55型荧光/磷光/发光光度计为实验平台的新型液滴光化学检测方法；构建了以流动注射分析和动态液滴传感技术相结合的多种新型荧光化学生物传感器，初步实现了自动化程度高、测试过程时间短、样品试剂消耗量低、实时在线的检测模式；首次研制开发出具有自主知识产权的集吸光检测与荧光检测于一体的动态液滴光化学生物传感仪器，从而实现了多通道、多组分、多信号的同时检测，为现代光化学生物传感器从原有的单参数式向多参数、多维乃至智能化方向的发展提供了可能性。 本论文开展的具体工作包括两大部分：第一部分：动态液滴光化学生物传感技术的原理与装置的研究系统阐述了动态液滴光化学生物传感技术的作用机制及工作原理；在以光纤传导为基础的动态液滴传感原理验证机的基础上，发展了以F-2500和LS55型荧光/磷光/发光光度计为基础的液滴传感装置，对光源、分光系统、检测系统、传输泵、液滴生成部分均做了较大幅度的改进，改善了仪器的性能，提高了检测灵敏度；研制开发了集吸光检测与荧光检测于一体的第三代动态液滴光化学生物传感仪器。 第二部分：动态液滴光化学生物传感技术在实际检测体系中的应用1.在无机离子检测体系中的应用基于酸性条件下，碘化钾可被溶液中的亚硝酸根或碘酸根氧化产生碘单质而使异硫氰酸荧光素或荧光素发生荧光猝灭的原理，对亚硝酸盐和碘酸盐进行检测。在优化条件下，体系荧光强度的变化值(△F)与亚硝酸根溶液的浓度(C)在25～100μg/L范围内呈线性关系，回归方程为△F=202.04+0.7435C；体系荧光强度的变化值(△F)与碘酸根溶液的浓度(C)在200～800μg/L范围内呈线性关系，回归方程为△F=-28.799+0.386C；利用该方法对环境水样中痕量的亚硝酸盐和食盐中碘酸盐的含量进行检测，取得满意的结果。2.结合固定化酶技术在有机分子检测体系中的应用 ①报道了一种基于凝胶网格中固定酶的流动注射液滴荧光分析方法用于溶液中微量L-赖氨酸的检测方法。实验中用丙烯酰胺作聚合剂，N,N-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，过硫酸铵作为引发剂，在光照或加热的情况下可交联形成凝胶。在酶均匀分散的情况下分别制成辣根过氧化酶酶柱和L-氨基酸氧化酶酶柱。L-氨基酸氧化酶可将溶液中的L-赖氨酸氧化生成过氧化氢，过氧化氢在辣根过氧化酶的催化作用下使TMB-d的荧光发生猝灭，TMB-d荧光强度变化值与溶液中L-赖氨酸的浓度存在相应的关系，以此为依据可测定溶液中微量的L-赖氨酸。在优化的实验条件下，溶液浓度为2.0×10-7mol/L到1.1×10-5mol/L范围内，体系荧光强度的变化值(△F)与L-赖氨酸的浓度(C)呈线性关系，回归方程为F0/F=0.9776+2.783×105C。 ②利用纳米颗粒具有比表面积大、吸附能力强的特点，将酶吸附在SiO2纳米颗粒表面，用易成膜的聚乙烯醇缩丁醛(PVB)做辅助基质在毛细管上固定酶，并采用分立式酶柱，克服了以往混合型酶柱普遍存在的酶促效率不高、使用寿命较短的局限性。所制得的酶柱具有表面反应活性高、表面活性中心多、催化效率高等特点。结合自行设计的液滴光化学生物传感装置，建立了一种高效、快速、微量的葡萄糖实时检测方法。在浓度(C)为2.0～400ng/mL范围内，荧光熄灭值(F0/F-1)值与C成良好的线性关系。3.在药物分子硫胺素分析体系中的应用 ①硫胺素在碱性条件下，被过氧化氢氧化可生成具有较强荧光的硫胺荧，其荧光强度取决于过氧化氢的浓度。基于此原理，利用可更新动态液滴光化学传感器对过氧化氢含量进行检测。在K2HPO4-NaOH缓冲溶液中，实现了过氧化氢在较宽线形范围内的快速测定，其线形响应范围为2.5×10-5mol/L～1.9×10-4mol/L，其检出限为4.88×10-6mol/L。②利用可更新动态液滴光化学传感技术对硫胺素在Hg2+作用下的在线氧化反应的荧光变化进行了研究。克服了传统光化学传感器中由于Hg2+易于出现沉淀而难以在比色皿中进行光度分析的缺点，进一步证实了液滴光化学传感技术可应用于不可逆反应体系。在最优条件下，硫胺素在1.5×104～3.0×10-6mg/mL范围内有较好的线形响应，检测限为3.0×104mg/mL。建立了一种高灵敏度、在线、实时、快速的硫胺素检测方法。③利用维生素B1、B2和B6在葡聚糖凝胶上的不同吸附性质及B1、B6在铁氰化钾碱性溶液中的荧光相反表现，应用于复合维生素B药片和人工合成样品的检测，获得了较为满意的结果。维生素B1、B2和B6在浓度分别为0.01～8.00μg/mL，0.01～10.00μg/mL和0.01～3.00μg/mL范围内呈线性关系，其检出限分别为0.008μg/mL、0.005μg/mL和0.006μg/mL。该方法测试速度快，所需样品量少；且可以克服以往荧光分析中由于B2和B6的光不稳定性所引起的测量误差和普遍出现的荧光吸收峰重迭现象。

目录

文摘

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第1章绪论

1.1前言

1.2表面可更新量测技术的液滴光化学传感器的研究

1.2.1液滴传感器的发展历程

1.2.2液滴光化学传感器的应用

1.3本文拟开展的研究工作

第2章动态液滴光化学生物传感装置的原理与设计

2.1前言

2.2基于光纤传导的液滴光化学传感原理验证机

2.2.1基本结构

2.2.2毛细管液滴光池的特点

2.2.3毛细管的硅烷化处理

2.2.4滴液头与入射光纤及检测光纤的相对位置

2.2.5吸光和荧光的同步检测

2.2.6多通道液滴传感信号分析

2.2.7仪器校正

2.3改进型液滴光化学生物传感装置

2.3.1基本结构与功能

2.3.2液滴头的改进

2.3.3改进型液滴光化学生物传感装置的特点

2.4新型同步荧光与吸光液滴光化学生物传感仪器

2.4.1仪器结构及各组成部分的基本功能与构造

2.4.2工作原理

2.4.3软件设计

2.4.4仪器性能及技术参数

2.4.5新型同步荧光与吸光液滴光化学生物传感仪器的创新点

第3章基于碘猝灭荧光的动态液滴光化学法用于亚硝酸根和碘酸根的测定

3.1前言

3.2实验部分

3.2.1主要仪器与试剂

3.2.2实验装置

3.2.3实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1基于异硫氰酸荧光素荧光猝灭的亚硝酸根测试体系

3.3.2基于荧光素荧光猝灭的碘酸根测试体系

3.4小结

第4章 基于固定化酶的流动注射液滴停留荧光法用于L-赖氨酸含量的测定

4.1前言

4.2实验部分

4.2.1主要仪器与试剂

4.2.2实验装置

4.2.3实验方法

4.3结果与讨论

4.3.1 TMB-d对L-赖氨酸的响应与测量原理

4.3.2酶柱的安装方式

4.3.3实验条件的优化

4.3.4 L-赖氨酸溶液的测定

4.3.5重现性

4.4小结

第5章纳米增强型毛细管酶柱用于葡萄糖液滴传感器的研究

5.1前言

5.2实验部分

5.2.1仪器与试剂

5.2.2实验方法

5.3结果与讨论

5.3.1 TMB-d的荧光性质与测量原理

5.3.2测量条件的优化

5.3.3干扰实验

5.3.4 工作曲线和测量范围

5.4小结

第6章 基于硫胺素荧光增强的过氧化氢液滴光化学传感器的研究

6.1前言

6.2实验部分

6.2.1仪器与试剂

6.2.2实验装置

6.2.3测量方法

6.3结果与讨论

6.3.1 H2O2对硫胺素的氧化作用

6.3.2硫胺荧的激发和发射光谱

6.3.3最优化检测条件的确定

6.3.4工作曲线及测量范围

6.3.5回收率测定

6.3.6实际样品的测定

6.4小结

第7章基于汞离子氧化作用的硫胺素液滴光化学传感器的研究

7.1前言

7.2实验部分

7.2.1仪器与试剂

7.2.2实验方法

7.2.3背景光的影响与信噪比

7.2.4信号的重现性

7.3结果与讨论

7.3.1硫胺素对Hg2+的荧光响应机理

7.3.2最优化检测条件的确定

7.3.3 工作曲线和测量范围

7.3.4样品分析

7.4小结

第8章基于固体基质的流动注射液滴荧光法用于复合维生紊B的联合测定

8.1前言

8.2实验部分

8.2.1主要仪器与试剂

8.2.2实验装置

8.2.3实验方法

8.3结果与讨论

8.3.1液滴光化学生物传感装置的改进

8.3.2葡聚糖凝胶对复合维生素B的选择性吸附

8.3.3维生素B1和B6混合溶液中维生素B6的测定及铁氰化钟碱性溶液对维生素B6的猝灭作用

8.3.4实验条件的优化

8.3.5应用

8.4小结

结论

参考文献

致谢

附录A：攻读博士学位期间所发表的学术论文