一维微流控微珠阵列芯片在核酸检测中的应用

摘要

一维微流控微珠阵列是一个新型的微分离分析平台，它有机地结合了微流控技术、阵列芯片技术以及微珠非均相识别技术。该平台设计灵活、操作简单、试剂消耗量少并可在单一微通道内实现高通量的生物样品并行分析，在生物微分离分析方面具有非常广阔的应用前景。为了进一步开发和拓展一维微流控微珠阵列芯片的应用，使其发展成为一种通用的生物检测平台。本文从一维微流控微珠阵列核酸检测方面着手，以逐步发展高灵敏、操作简单、低成本的核酸检测方法为研究主线，主要开展了以下几方面工作： (1) 发展了一种基于固定化分子信标检测原理的多目标核酸检测一维微流控微珠阵列。首先，基于肿瘤相关基因p53、c-myc和cyclin d1的mRNA序列保守区分别设计合成了三种分子信标，并将其修饰到微珠表面，通过显微操作将微珠转移到一维微流控微珠阵列中。通过对微珠修饰条件、微通道修饰方法、缓冲液离子强度、固定化分子信标杂交动力学及对目标选择的特异性等实验条件或影响因素的考察和优化，在一维微流控微珠阵列上实现了对合成的多目标cDNA样品及细胞抽提mRNA的扩增产物的特异性检测。该一维微流控微珠阵列对目标核酸在浓度为0.5 nM到100 nM范围内呈线形响应。固定化分子信标结合一维微流控微珠阵列操作简单、样品体积小、无需样品标记。本实验不仅证实了一维微流控微珠阵列用于进行多目标的核酸检测的可行性，并且为使这一新型的微珠阵列发展成为一种通用型的检测平台迈出了非常重要的一步。 (2) 设计了一种可限制性酶切的固定化分子信标用于一维微流控微珠阵列核酸检测。考虑到表面效应对固定化分子信标所带来的负面影响，如设计参数不容易掌握，并通常难于达到理想的荧光恢复效率等问题，在分子信标发央结构的茎状部分术端增加了延长链以减小表面效应的影响，同时在其环状部分包含一个限制性酶切位点。通过酶切作用可以使信标与目标结合之后，帮助其进一步打开分子信标的发夹结构，提高荧光恢复效率。在本工作中酶切的方法可使分子信标荧光增强倍数从2.7提高到5.2，接近其在溶液中的荧光增强倍数。通过酶切一方面可以在一定程度上提高固定化分子信标的检测灵敏度，另一方面也降低了固定化分子信标的设计要求，即使荧光恢复效率不是很高的固定化分子信标也可得到比较理想的应用，这也为固定化分子信标技术在一维微流控微珠阵列上开展更广泛的应用打下了基础。 (3) 发展了一种高灵敏而且无需洗脱的以分子信标作为报告探针的新型三明治结构探针。为进一步提高一维微流控微珠阵列核酸检测的灵敏度，将传统的核酸三明治探针检测手段与分子信标技术相结合，同时利用了三明治结构探针检测荧光背景低、灵敏度高以及分子信标无需样品标记和洗脱的优点，结合一维微流控微珠阵列，对药物刺激前后的A549细胞系中肿瘤相关基因c-myc的mRNA表达直接进行检测。该技术操作简单，并且无需扩增即可直接进行细胞抽提mRNA的检测。 (4) 发展了一种基于荧光聚噻吩检测原理的一维微流控微珠阵列核酸高灵敏检测新方法。针对核酸探针标记成本高的缺陷，以及高灵敏的三明治核酸检测方法需要在进样后再次进行荧光报告探针与样品杂交使用户操作复杂度提高的问题，将基于阳离子型的噻吩聚合物的核酸检测方法与一维微流控核酸微珠阵列平台有机地结合在一起，将均相体系中基于阳离子型聚噻吩核酸检测成功地拓展到非均相介质上的核酸检测中，发展了操作简单、成本低、灵敏度高的核酸检测方法，为一维微流控核酸微珠阵列的更广泛的应用提供了条件。 (5) 基于模式滤光检测原理，在环形微通道中通过对生物固定相的sol-gel包埋，发展了一种新型的模式滤光检测环形微通道电色谱技术，用于生物样品微分离研究，为进一步发展以微通道为基础的微分离分析及检测技术提供了一种新的思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:本文所用英文缩写词表

声明

第1章 绪论

1.1核酸检测的重要性及面临的挑战

1.2核酸检测方法及进展

1.3微芯片技术及其在核酸检测中的应用

1.3.1微阵列芯片

1.3.2微流控芯片

1.4微珠技术在核酸检测中的应用

1.5一维微流控微珠阵列的发展

1.6本文拟开展的研究工作

第2章 固定化分子信标用于一维微流控微珠阵列多目标核酸检测

2.1前言

2.2实验部分

2.2.1仪器和试剂

2.2.2实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1一维微流控分子信标微珠阵列的构建

2.3.2通道改性处理

2.3.3分子信标的设计和其在溶液中的性能

2.3.4 Mg2+离子浓度的影响

2.3.5微珠修饰的条件优化

2.3.6固定化分子信标的杂交动力学考察

2.3.7 p53分子信标一维阵列的灵敏度、响应范围

2.3.8在一维微流控微珠阵列上同时检测多目标cDNA

2.3.9一维微珠阵列上对多个不同浓度实际样品cDNA的同时检测

2.3.10 RT-PCR验证

2.4小结

第3章 可限制性酶切的固定化分子信标用于一维微珠阵列核酸检测

3.1前言

3.2实验部分

3.2.1仪器和试剂

3.2.2一维微流控微珠阵列的构建

3.2.3微珠表面修饰

3.2.4杂交和酶切

3.2.5固定化分子信标的退火温度考察

3.3结果与讨论

3.3.1分子信标的设计

3.3.2分子信标在均相溶液体系中的性质考察

3.3.3分子信标在固体界面的性质考察

3.3.4分子信标的退火温度考察

3.3.5可酶切固定化分子信标在一维微流控微珠阵列上的应用

3.4小结

第4章 以分子信标作为报告探针的免洗脱三明治检测方法用于一维微流控微珠阵列核酸检测

4.1前言

4.2实验部分

4.2.1仪器和试剂

4.2.2微珠的生物功能化修饰

4.2.3一维微流控微珠阵列芯片的构建

4.2.4 mRNA样品制备

4.2.5样品杂交和检测

4.2.6 RT-PCR及琼脂糖电泳过程

4.3结果与讨论

4.3.1实验原理及探针的设计

4.3.2分子信标在溶液中的杂交特性荧光测定

4.3.3一维微流控微珠阵列中的分子信标报告探针与固定化的分子信标性能比较

4.3.4一维微流控微珠阵列中分子信标检测的特异性考察

4.3.5一维微流控微珠阵列芯片内对不同浓度目标核酸的检测

4.3.6芯片内对实际mRNA样品的检测及RT-PCR验证

4.4小结

第5章 基于阳离子型荧光聚噻吩的一维微流控微珠阵列核酸检测

5.1前言

5.2实验部分

5.2.1仪器和试剂

5.2.2阳离子型聚噻吩的合成

5.2.3琼脂糖微珠的生物修饰

5.2.4一维微流控微珠阵列芯片的构建

5.2.5均相溶液中利用聚噻吩检测目标cDNA

5.2.6一维微流控微珠阵列内核酸cDNA检测

5.3结果与讨论

5.3.1实验原理

5.3.2阳离子型聚噻吩的荧光特性

5.3.3阳离子聚噻吩的熄灭效率考察

5.3.4阳离子型聚噻吩的荧光恢复特性

5.3.5阳离子型聚噻吩与核酸作用的吸收光谱性质

5.3.6基于阳离子型聚噻吩的一维微流控微珠阵列核酸检测

5.4小结

第6章 基于模式滤光检测的环形微通道电色谱微分离技术研究

6.1前言

6.1.1光纤化学传感器与模式滤光检测

6.1.2毛细管微通道电泳技术

6.1.3本章的研究意义

6.2实验部分

6.2.1主要试剂

6.2.2仪器构造

6.2.3实验方法

6.3结果与讨论

6.3.1检测原理

6.3.2 Sol-gel键合条件及BSA活性的保持

6.3.3 Sol-gel涂层表面形貌的AFM表征

6.3.4 Sol-gel包埋BSA涂层的FT-IR表征

6.3.5信号采集像元与入射角的选择

6.3.6环行微通道固定相接触面积

6.3.7修饰剂的影响

6.3.8体系的热效应

6.3.9不同尺寸环形微通道的电泳电流考察

6.3.10环形微通道中的D，L-色氨酸的手性分离

6.4小结

结论

参考文献

附录

致谢