基于核酸探针和金纳米颗粒的小分子和酶活性电化学检测

摘要

生物传感器的研究已经成为分析化学和生物化学领域中一个非常重要的研究方向,并在医疗、医药、生物工程、环境保护、食品等领域具有广泛的应用前景。其中,电化学生物传感器是基于生物识别的高度专一性和电化学信号发展起来的一种分析技术,具有灵敏度高、选择性好、成本低、易于微型化等优点,人们对此作出了深入和广泛的研究。纳米材料由于具有尺寸小、比表面积大、生物相容性好等一些特殊的性质而受到人们的广泛关注。大量研究表明,将纳米材料应用于电化学生物传感器中,可以大大提高生物传感器的响应性能,为生物医学、环境监测和生物分析等领域提供新的研究途径。本论文瞄准这一研究热点,将生物化学、纳米技术和电分析化学理论和方法有机地结合起来,构建了基于生物识别的高度专一性和灵敏性的电化学生物传感器,并将其应用于对生物小分子和酶活性的检测,主要包括以下三方面的研究工作:
　　 一、基于发夹型DNA和E.coli DNA连接酶的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸电化学检测利用发夹型DNA探针和E.coli DNA连接酶发展了一种高灵敏、高特异NAD+电化学检测新方法。在该方法中,发夹型DNA的3'端修饰巯基,5'端修饰生物素,以茎环状自组装修饰到金电极上,当检测体系中无NAD+时,生物素靠近电极表面,阻碍电子传递,处于“eT OFF”状态;当检测体系中有NAD+存在时,E.coli DNA连接酶被激活,两段与发夹型DNA环部互补的DNA片段发生连接反应将发夹型DNA打开,生物素远离电极表面,发生电子的自由传递,产生可测量的电化学信号(eT ON)。采用该方法实现了对NAD+的特异性检测,其线性范围为3 Nm-5μm,检测下限为1.8 Nm。
　　 二、基于金纳米颗粒的电化学传感器检测端粒酶的研究利用端粒酶可以以自身为模板进行逆转录的特点和金纳米颗粒较大的比表面积能够承载较多核酸片段的特点,构建了一种检测肿瘤细胞中端粒酶活性的电化学方法。将末端含有端粒酶引物片段的模板DNA链修饰在金纳米颗粒修饰的电极上,末端标记亚甲基蓝(MB)的信号探针与电极上的模板DNA互补配对,MB能够与电极表面发生电子传递,产生可测量的电化学信号。在加入端粒酶和dNTPs后,端粒酶引物片段不断延伸,延伸后的DNA片段可以与模板DNA互补配对,将已经连接了的检测链竞争下来,游离出的信号探针末端电活性物质MB远离电极表面,阻碍了与电极表面的电子传递,电化学信号变小,这是一个信号从无到有再到无的过程,从而实现对端粒酶的检测。该方法可以检测出2×102个/mLHela细胞内的端粒酶。
　　 三、基于金纳米颗粒的放大作用对DNA聚合酶KF-的电化学检测利用金纳米颗粒具有较小尺寸、容易被带到电极表面以及较大的比表面积能够承载较多核酸片段的特点,发展了一种简便、快速检测DNA聚合酶KlenowFragment(exo-)(KF-)的电化学方法。在该方法中,首先将巯基修饰的引物片段修饰在电极上,加入模板DNA以及标记DNA的金纳米颗粒后,由于引物片段和标记在金纳米颗粒上DNA都能与模板链进行杂交,从而使得模板链同时连接了引物片段和金纳米颗粒标记的DNA(AuNPs-DNA)片段,再加入电活性物质RuHex,RuHex能通过静电吸附作用结合在电极表面的DNA上,由于AuNPs带来的DNA在电极表面堆积,从而能够吸附大量的RuHex,使得RuHex与电极表面电子传递增强,产生电化学信号。当加入dNTPs以及DNA聚合酶时,引物片段发生延伸反应,延伸的DNA链能够将标记了DNA的AuNPs竞争下来,AuNPs被游离出来并带走大量的RuHex,信号减小,从而实现对聚合酶的检测。该方法可以检测到5 U/Ml的KF-。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:本文常用英文缩略词表

第1章 绪论

1.1 电化学生物传感器

1.1.1 电化学生物传感器的原理

1.1.2 电化学生物传感器的分类

1.1.3 电化学生物传感器的发展

1.2 核酸探针在电化学DNA传感器中的应用

1.2.1 分子信标型DNA

1.2.2 核酸适体

1.3 纳米材料在电化学生物传感器中的应用

1.3.1 金纳米颗粒在电化学生物传感器中的应用

1.3.2 碳纳米管在电化学传感器中的应用

1.4 本文拟开展的工作

第2章 基于分子信标型DNA和E.COLIDNA连接酶的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸电化学检测

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂和仪器

2.2.2 金电极的处理和分子信标型DNA在电极表面的固定.

2.2.3 NAD+的电化学检测

2.2.4 分子信标型DNA修饰电极的再生

2.3 结果与讨论

2.3.1 NAD+的电化学检测原理

2.3.2 传感器的电化学表征及可行性的考察

2.3.3 实验条件的优化

2.3.4 对不同浓度NAD+检测的工作曲线

2.3.5 电化学传感器的选择性

2.3.6 传感器的再生

2.4 小结

第3章 基于分子探针和金纳米颗粒对端粒酶活性的电化学检测

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 实验试剂和仪器

3.2.2 金纳米颗粒的制备

3.2.3 金电极的预处理

3.2.4 修饰电极的制备

3.2.5 修饰电极上模板DNA与信号探针的杂交

3.2.6 细胞培养与提取

3.2.7 模板DNA链的延伸与端粒酶活性的检测

3.3 结果与讨论

3.3.1 基于金纳米颗粒检测端粒酶活性的电化学原理

3.3.2 金纳米颗粒表征以及金电极的修饰

3.3.3 实验可行性的考察

3.3.4 实验条件的考察

3.3.5 对不同Hela细胞提取端粒酶活性的考察

3.4 小结

第4章 基于金纳米颗粒信号放大作用电化学检测聚合酶

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 实验试剂与仪器

4.2.2 金电极的预处理及修饰

4.2.3 检测KF-活性

4.3 结果与讨论

4.3.1 实验原理

4.3.2 金纳米颗粒修饰DNA的表征

4.3.3 修饰电极的表征

4.3.4 实验可行性的考察

4.3.5 实验条件的优化

4.3.5 KF-聚合酶的定量分析

4.4 小结

结论

参考文献

附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢