基于量子点和核酸适体的肺癌细胞识别与检测

摘要

核酸适体(Aptamer)是经“指数富集的配体系统进化”(systematic evolutionof ligands by exponential enrichment,SELEX)技术体外筛选得到的、由DNA或RNA组成的短的单链核苷酸序列。它与目标物结合具有高特异性和高亲和力的特点,并且容易合成与修饰,稳定性好,目标物种类广泛,免疫原性低,越来越多地应用于生物分析、化学生物学等领域。量子点具有优越的光物理性能,如荧光量子产率高、光稳定性强、可以实现一元激发多元发射等等,在分子诊断、靶向治疗、生物医学成像与生物传感等方面得到了广泛应用。本论文以非小细胞肺癌A549细胞为研究对象,以核酸适体为特异性识别基元,为了提高颗粒的细胞识别效率,发展简单、通用的癌细胞检测方法,完成了以下工作:
　　 1.基于核酸适体荧光探针定量测定细胞表面膜受体蛋白的分布密度
　　 利用能与细胞膜受体蛋白高特异性结合的核酸适体荧光探针,以A549细胞为识别对象,通过测定核酸适体探针与A549细胞孵育前后荧光强度的变化,定量测定A549细胞表面核酸适体靶向的膜受体蛋白的分布密度。结果表明,平均每个A549细胞表面核酸适体的目标膜受体蛋白数目约为8.4×105个,分布密度约为1050个/μm2,该分布密度保证体积较大的量子点可以作为荧光标记物用于癌细胞识别,为量子点结合核酸适体用于A549细胞的识别提供了保障。
　　 2.基于量子点和核酸适体的非小细胞肺癌A549细胞的特异性识别
　　 用量子点作为核酸适体的标记物,采用分步识别法(核酸适体先识别细胞,再用量子点进行荧光标记)实现了对A549细胞的特异性识别。考察了两条核酸适体Slle、S6在不同温度下对A549细胞的识别差异,并对量子点孵育时间、孵育浓度进行了优化。结果表明,4℃和37℃,Slle、S6都能特异性识别A549细胞。量子点孵育时间为60 min时,荧光信号最强;量子点浓度为300nM时,阳性信号和背景间的差异最大。该工作说明了分步识别法可以实现A549细胞的高效识别,为进一步的细胞检测奠定基础。
　　 3.基于量子点和核酸适体对A549细胞的定量检测
　　 在第二部分工作基础之上,比较了分步识别法与一步识别法(量子点、核酸适体先形成复合物,再进行细胞识别)的细胞成像效果。结果表明,基于量子点和核酸适体的分步识别法避免了空间位阻对核酸适体构象的影响,相比于一步识别法,特异性更高,信背比约是一步识别法的3倍。在此基础上,结合量子点荧光强度高、光稳定性强、信背比高等优势,实现了非小细胞肺癌A549细胞的定量检测,检测限达到6×103 cells/mL。因此,基于量子点和核酸适体的分步识别法具有操作简单、特异性好、灵敏度高等优势,有望应用于肿瘤的早期诊断与治疗。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:本文所用英文缩写词表

第1章 绪论

1.1 核酸适体

1.1.1 核酸适体的筛选

1.1.2 核酸适体的识别基础

1.1.3 核酸适体的基本性能

1.2 核酸适体与纳米材料的联用

1.2.1 核酸适体与纳米材料结合的特点

1.2.2 核酸适体与纳米材料的交联

1.3 核酸适体结合不同纳米材料在癌细胞的检测与治疗中的应用

1.3.1 量子点

1.3.2 二氧化硅纳米颗粒

1.3.3 金纳米材料

1.3.4 聚合物纳米颗粒

1.4 本论文拟开展的工作

第2章 基于核酸适体荧光探针定量测定细胞表面膜受体蛋白的分布密度

2.1 前言

2.2 实验部分

2.2.1 试剂和仪器

2.2.2 实验方法

2.3 结果与讨论

2.3.1 实验原理

2.3.2 核酸适体荧光探针对A549细胞的特异性识别

2.3.3 确定核酸适体的目标物为膜受体蛋白

2.3.4 核酸适体探针的荧光强度对浓度的标准曲线

2.3.5 膜受体蛋白的定量

2.4 小结

第3章 基于量子点和核酸适体对非小细胞肺癌A549的特异性识别

3.1 前言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂和仪器

3.2.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 实验原理

3.3.2 量子点的合成及修饰

3.3.3 量子点的光谱表征

3.3.4 生物素化量子点的尺寸与电位表征

3.3.5 量子点表面生物素修饰效果的考察

3.3.6 基于量子点和核酸适体对A549细胞的特异性识别

3.3.7 细胞Z轴扫描

3.3.8 量子点孵育时间与浓度的影响

3.3 小结

第4章 基于量子点和核酸适体用于A549细胞的定量检测

4.1 前言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和仪器

4.2.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 实验原理

4.3.2 QDs-Slle复合物的表征

4.3.3 基于量子点和核酸适体的分步识别法与一步识别法的比较

4.3.4 量子点与有机染料光学性能的比较

4.3.5 A549细胞的定量检测

4.4 小结

结论

参考文献

附录A 细胞培养

附录B 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢