拟南芥蓝光受体隐花素CRY2光激发机理和功能的生化分析

摘要

蓝光受体隐花素Cryptochrome(CRY)是一类光裂解酶类似的黄素蛋白，介导了植物和动物的各种光响应，但是其光化学机理还不是很清楚。有研究者提出隐花素的光激发牵涉到生色团黄素腺嘌呤二核苷酸Flavin adenine dinucleotide(FAD)依赖蓝光的光还原反应，此还原反应是通过蛋白内进化上高度保守的三个色氨酸组成的电子传递链完成的，这三个保守的色氨酸被定义为色氨酸三联体。色氨酸三联体高度保守于光裂解酶/隐花素家族中，其在光还原中的功能是首次在光裂解酶中发现的，但到目前为止已有研究证明依赖色氨酸三联体的光还原反应与光裂解酶体内光依赖的酶活性没有相关性。最近的研究还证明依赖色氨酸的光还原反应不是动物Ⅰ型隐花素体内光依赖活性所必需的，但是对拟南芥隐花素Cryptochromel(CRY1)的一些研究结果支持依赖色氨酸的光还原决定了植物的生理功能。为了研究植物隐花素的光激发机理，将拟南芥隐花素Cryptochrome2(CRY2)的色氨酸三联体逐个突变，通过对突变的隐花素CRY2光化学和生理学活性的分析来研究以上提出的光还原假设，得到以下几点结论：
　　(1)证明了色氨酸三联体确实参与了隐花素CRY2体外的光还原反应，但是在所有被检测的生理生化活性中，包括幼苗去黄化响应、成株开花、CRY2依赖蓝光的降解活性及蛋白与蛋白的互作，没有一个在色氨酸突变体中被消除，表明依赖色氨酸三联体的光还原反应不是拟南芥隐花素CRY2功能必需的。
　　(2)一些CRY2色氨酸突变体(如CRY2W374A)在被检测的生理响应中呈现出组成型活性，变得更活跃。CRY2W374A突变体蛋白与CRY2信号蛋白Suppressorof PHYA1(SPA1)和Cryptochrome-Interaction Basic Helix-Loop-Helix(CIB1)不依赖蓝光互作，其组成型相互作用支持了光诱导隐花素构象改变的假说，从生物化学角度解释了为什么CRY2色氨酸突变体能够在没有光的条件下组成型活跃。
　　(3)真核体系表达的拟南芥CRY2蛋白结合生色团FAD并保持了蓝光受体的活性，在体外响应蓝光，受蓝光诱导形成二聚体或多聚体，并且ATP能够促进CRY2的二聚化或多聚化，证明蓝光促使CRY2构象的改变。CRY2W374A突变体蛋白在黑暗和蓝光下均能以二聚体形式存在，蓝光能够促进突变体蛋白的二聚化和多聚化。
　　(4)首次发现植物隐花素在体外蓝光特异的蛋白与蛋白互作现象。体外CRY2-CIB1复合体的形成依赖于蓝光与FAD，与体内反应一致。突变体蛋白CRY2W374A在体外能与CIB1持续性结合，支持蓝光诱导CRY2构象的改变，突变体CRY2W374A更接近构象改变后的CRY2。
　　(5)限制性蛋白水解实验首次揭示蓝光能够诱导体外CRY2构象改变，被激活的CRY2空间构象类似于组成型突变体CRY2W374A。鉴定到蓝光诱导CRY2构象改变的位置位于CRY2C端结构域，靠近保守基序DAS中STAESSS序列。光诱导CRY2构象改变正好解释了依赖蓝光的CRY2-CIB1、CRY2-SPA1的相互作用，支持光诱导CRY2PHR-CCT解离论。
　　(6)不同类型细胞中的CRY2有可能拥有不同的生理功能，不同的功能间(如促进光周期控制的开花，抑制下胚轴生长等)存在不同的调控机理。本论文构建的转基因植物：组织特异性启动子启动荧光蛋白GFP、mRNA结合蛋白PABP、隐花素CRY1、CRY2基因的表达，为进一步研究隐花素纵多功能的调控机理和信号传递途径提供了丰富材料。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写词

第1章 绪论

1.1 拟南芥蓝光/Uv-A受体-隐花素

1.1.1 植物光受体

1.1.2 隐花素的发现

1.1.3 隐花素/光裂解酶家族

1.2 隐花素的功能

1.2.1 拟南芥隐花素的表达与亚细胞定位

1.2.2 拟南芥隐花素的功能

1.3 隐花素的结构

1.3.1 光裂解酶的结构与光化学机制

1.3.2 拟南芥隐花素CRY1PHR结构域

1.3.2 拟南芥隐花素C端延伸区CCT结构域

1.3.3 拟南芥隐花素光激发机制与光化学特性

1.4 隐花素介导的蓝光信号传导途径

1.4.1 拟南芥隐花素传导途径中的信号蛋白

1.4.2 蓝光响应途径

1.5 动物隐花素

1.6 本论文的构想

第2章 拟南芥隐花素通过不依赖于色氨酸三联体光还原反应的光激发机制行使功能

2.1 实验材料与方法

2.1.1 植物材料

2.1.2 酵母双杂交

2.1.3 体外隐花素CRY2和CIB1蛋白的表达、纯化和分析

2.1.4 体外蛋白与蛋白的相互作用

2.2 实验结果与分析

2.2.1 隐花素CRY2体外光还原反应依赖色氨酸三联体

2.2.2 拟南芥隐花素CRY2体内生理功能不依赖色氨酸三联体参与的光还原反应

2.2.3 隐花素CRY2依赖蓝光的降解活性不需要依赖色氨酸参与的光还原反应

2.2.4 隐花素CRY2W374A/F突变体在黑暗下抑制向地性

2.2.5 隐花素某些色氨酸三联体突变导致CRY2组成型活跃

2.3 讨论

第3章 蓝光诱导体外隐花素CRY2寡聚体的形成

3.1 实验材料与方法

3.1.1 溶液配制

3.1.2 蛋白表达、纯化与光处理

3.2 实验结果与分析

3.2.1 昆虫细胞表达突变体CRY2W374A蛋白出现二聚体

3.2.2 体外CRY2二聚化依赖蓝光与FAD

3.2.3 纯化后的CRY蛋白依然响应蓝光出现多聚化现象

3.2.4 蓝光诱导体外CRY2多聚化并被ATP促进

3.2.5 体外pull-down实验显示CRY2依赖蓝光的二聚化现象

3.2.6 CRY2与CRY2W374A蛋白可能存在构象上的差异

3.3 讨论

第4章 蓝光诱导体外隐花素CRY2构象改变

4.1 实验材料与方法

4.1.1 植物突变体分析

4.1.2 一级结构分析

4.1.3 二级结构预测

4.1.3 胰蛋白酶识别位点预测

4.1.4 蛋白表达与纯化

4.1.5 限制性蛋白水解

4.2 实验结果与分析

4.2.1 拟南芥CRY2D393A突变体出现cop1表型

4.2.2 采用胰蛋白酶消化实验研究CRY2蓝光诱导的构象重组

4.2.3 蓝光促进CRY2水解

4.2.4 胰蛋白酶消化实验揭示蓝光诱导了CRY2构象改变

4.2.5 胰蛋白酶消化实验显示CRY2Q374A在蓝光和黑暗下呈现出稳定的构象

4.2.6 组成型光响应突变体CRY2W374A结构类似于蓝光下CRY2

4.3 讨论

第5章 采用组织特异表达方法研究拟南芥的功能

5.1 实验设计与方法

5.1.1 选取组织特异性启动子

5.1.2 载体的选取

5.1.3 转基因植株构建与筛选

5.1.4 荧光激活细胞分类

5.1.5 Promoter-PABP-poly(A)pull-down分离法

5.2 实验结果与分析

5.2.1 组织特异性启动子启动GFP在不同组织中特异表达

5.2.2 不同组织中表达的CRY2调控植物不同的生理过程

5.3 讨论

结 论

参考文献

附录A 红光下拟南芥光敏素调节基因的蛋白质鉴定与mRNA分析

A1 实验材料与方法

A1.1 植物生长条件和光源

A1.2 拟南芥幼苗总蛋白的提取

A1.3 双向凝胶电泳

A1.4 蛋白质染色与图像分析

A1.5 蛋白质的原位酶解

A1.6 MADLI-TOF-TOF肽质指纹图分析及数据搜索

A1.7 RT-PCR分析

A2 前沿

A3 实验结果与分析

A3.1 双向电泳鉴定光敏素调节蛋白

A3.2 差异蛋白功能分类与亚细胞定位分析

A2.3 红光下PHYAPHYB突变影响了基因蛋白水平的积累

A2.4 红光下PhyA与phyB影响基因mRNA水平的表达

A3 结论

A 参考文献

攻读学位期间所发表的学术论文目录

致 谢