DNA损伤修复通路在细胞应对银纳米颗粒刺激中作用的研究

摘要

研究发现银纳米颗粒(AgNPs)有一定的细胞毒性和基因毒性，它会引起ROS增加而导致ATP合成异常、DNA损伤、细胞凋亡和坏死等。但是人体细胞是如何应答AgNPs的胁迫目前尚不清楚，DNA损伤修复通路是否参与AgNPs引起的细胞应答反应是研究的一个空白点。本论文阐明了DNA损伤修复通路参与细胞应答AgNPs引起的胁迫，并且起重要作用。
　　本文首先通过集落形成实验研究不同浓度的AgNPs对正常人体细胞和有DNA损伤修复通路缺陷的人体细胞分裂增殖的影响。与正常细胞相比，存在核苷酸切除修复通路(NER)缺陷的XPC、XPF细胞系的集落形成能力显著降低。XPF同时参与部分DNA链间交联(ICLs)损伤修复，在XPF点突变的细胞内不能正常应答AgNPs引起胁迫，表现出细胞正常的生长受到抑制。实验结果初步说明人体细胞应答AgNPs引起的胁迫需要DNA损伤修复通路的参与。
　　用不同AgNPs浓度处理48小时后，在有NER缺陷的XPF细胞中p53蛋白含量明显增加，同时p53蛋白Ser15位点磷酸化的程度显著增加，可以推断XPF突变细胞经AgNPs处理后生长受到抑制是因为p53调控的网络被激活，从而引导细胞进入周期停滞、细胞凋亡等反应状态，进一步证实了p53调控的相关基因转录被激活，如MDM2、APAF1等的转录在XPF细胞中显著变化，而在正常细胞中没有明显变化。阐明了XPF参与的DNA损伤修复通路在细胞应对AgNPs引起的胁迫刺激中发挥积极的作用。
　　同时本文证实了Fe3O4NPs也会抑制XPF缺陷细胞的正常生长，但是在细胞内p53调控的应答网络没有激活；与细胞周期相关的CHEK1及DNA损伤修复相关的RPA1、RPA2和RPA3的转录却有显著变化。这表明人体细胞应对不同纳米颗粒的刺激有共性也有特异性。
　　综上所述，XPF参与的DNA损伤修复通路不只是在细胞应对AgNPs的刺激中发挥重要的作用，人体细胞同样需要DNA损伤修复通路应对Fe3O4NPs造成的胁迫。因此，DNA损伤修复通路是人体细胞应对AgNPs/Fe3O4NPs刺激中的不可或缺的部分。

目录

文摘

英文文摘

插图索引

第1章 绪 论

1.1 银纳米颗粒概述

1.1.1 银纳米颗粒的性质

1.1.2 银纳米颗粒的应用

1.1.3 银纳米颗粒毒性的研究现状

1.1.4 Fe3O4纳米颗粒(Fe3O4NPs)的应用

1.1.5 Fe3O4纳米颗粒的毒性研究

1.2 DNA损伤修复通路

1.2.1 核苷酸切除修复通路

1.2.2 核苷酸切除修复通路机制

1.2.3 DNA链间交联损伤修复

1.2.4 XPF的作用

1.3 DNA损伤应答相关蛋白与基因

1.3.1 ATM/ATR DNA损伤应答网络

1.3.2 p53调控的应答网络

1.3.3 细胞周期检验点

1.3.4 DNA损伤修复基因BRCA1与BRCA2

1.3.5 核糖核苷酸还原酶

1.4 论文研究思路

第2章 银纳米颗粒对人体细胞分裂增殖的影响

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验仪器及耗材

2.2.2 材料与试剂

2.2.3 银纳米颗粒的制备

2.2.4 银纳米颗粒释放物的提取

2.2.5 集落形成实验

2.3 结果与讨论

2.3.1 银纳米颗粒的表征

2.3.2 集落形成实验结果

2.3.3 AgNPs作用方式的初步检测

2.4 小结

第3章 银纳米颗粒对p53调控网络的影晌

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验仪器

3.2.2 材料与试剂

3.2.3 细胞体外培养

3.2.4 蛋白免疫印迹

3.2.5 总RNA提取

3.2.6 总RNA检测

3.2.7 总RNA的提纯

3.2.8 RNA逆转录

3.2.9 PCR体外扩增与检测

3.3 结果与讨论

3.3.1 p53蛋白免疫印迹

3.3.2 p53 Ser15位点磷酸化蛋白免疫印迹

3.3.3 RT-PCR实验结果分析

3.4 小结

第4章 XPF参与的DNA损伤修复通路在应对Fe3O4纳米颗粒中的作用

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验仪器

4.2.2 材料与试剂

4.2.3 集落形成实验

4.2.4 总RNA提取

4.2.4 总RNA检测

4.2.5 总RNA提纯

4.2.6 RNA逆转录

4.2.7 PCR体外扩增与检测

4.3 结果与讨论

4.3.1 集落形成实验结果

4.3.2 RT-PCR实验结果分析

4.4 小结

结 论

参考文献

附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致 谢