AdFOXM1shRNA在鼻咽癌和乳腺癌基因治疗中的疗效分析

摘要

癌症是21世纪困扰人类的难题之一，给人类健康和生命安全带来严重威胁。其中，鼻咽癌是中国南方和东南亚最常见的恶性肿瘤之一，每年大约十万人中就有20例鼻咽癌发生，其发病率和死亡率均居头颈恶性肿瘤首位。乳腺癌是女性排名第一的常见恶性肿瘤，是导致女性死亡的重要原因，且发病率呈逐年上升的趋势，成为全球公共卫生的一大难题。由于传统的治疗癌症的方法如化疗，放疗存在毒副作用等严重缺陷，寻找癌症治疗的新方法和新靶点已成为近年来的研究热点。
　　 FOXM1属于Forkhead Box转录因子家族，参与调节细胞增殖、细胞衰老、DNA损伤修复、器官形成等很多重要的生理过程。大量文献表明FOXM1在多种人类恶性肿瘤中都有过表达的现象，其中包括乳腺癌，但是FOXM1在鼻咽癌中的作用还未见文章报道。本文中我们研究发现FOXM1在鼻咽癌组织和细胞株，以及乳腺导管癌组织和细胞株中均存在高水平的表达。另外，有研究发现FOXM1在维持肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和转移的平衡方面扮演了重要的角色。这些证据预示着FOXM1有可能成为抗肿瘤新方法的靶标。
　　 腺病毒是目前基因治疗的主要载体，具有宿主范围广、感染效率高、滴度高、安全性好，能容纳大片段的外源DNA等优点。RNA干扰是基因治疗中常用的分子工具之一，然而小分子干扰RNA导入靶细胞的效率高低是其成功应用的关键。为了解决这一问题，本课题中我们构建了一个腺病毒介导的shRNA表达系统，命名为AdFOXM1shRNA，用以在肿瘤细胞中特异性的干扰FOXM1的表达，进而研究该载体在鼻咽癌和乳腺癌基因治疗中的初步的疗效分析。通过实验，我们得到了以下结果。
　　 首先，摸索本研究所选择的三株细胞中合适的病毒使用剂量，这三株细胞分别是鼻咽癌细胞CNE以及乳腺癌细胞MDA-MB-231和ZR-75-30。实验发现用10 pfu/cell的对照病毒AdLacZ感染这三株细胞都几乎能达到100％的感染效率。并且，实验证明在该剂量下我们所构建的AdFOXM1shRNA载体能够非常有效的干扰鼻咽癌和乳腺癌细胞中FOXM1的表达。
　　 接着，我们考察了干扰FOXM1的表达对肿瘤细胞增殖能力的影响。与预期的一样，鼻咽癌细胞CNE和乳腺癌细胞MDA-MB-231，ZR-75-30感染AdFOXM1shRNA后，由于FOXM1的表达下降，细胞周期相关基因的表达也随之下降，细胞周期被阻断，细胞的增殖能力被严重抑制。
　　 然后，我们检验了FOXM1在肿瘤的发生过程中是否起作用。通过软琼脂克隆形成实验我们看到，感染AdFOXM1shRNA的鼻咽癌细胞CNE和乳腺癌细胞ZR-75-30的克隆形成率大大降低，细胞的非贴壁依赖性生长的能力被抑制;而动物实验的结果显示，FOXM1的缺失降低了乳腺癌细胞ZR-75-30生成肿瘤的能力。两组实验分别在体外和体内证实了肿瘤的发生有赖于FOXM1的存在。
　　 最后，我们通过建立裸鼠移植瘤模型考察了FOXM1对肿瘤生长的影响。鼻咽癌和乳腺癌的体内实验的结果表明，瘤内注射AdFOXM1shRNA能够降低肿瘤组织中FOXM1的表达水平，进而抑制肿瘤的生长，显示出FOXM1对于肿瘤的生长的重要性，预示着AdFOXM1shRNA应用于鼻咽癌和乳腺癌基因治疗的潜在可能。

目录

声明

摘要

英文缩写

第1章 绪论

1．1 癌症简述

1．2 基因治疗

1．2．1 基因治疗的概念

1．2．2 基因治疗的分类

1．2．3 基因治疗的发展现状

1．3 腺病毒载体

1．3．1 腺病毒载体简介

1．3．2 腺病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用

1．4 转录因子FOXM1

1．4．1 FOXM1基因介绍

1．4．2 FOXM1的生物学功能

1．4．3 FOXM1与肿瘤

1．5 本文构思及研究内容

第2章 FOXM1在肿瘤组织和细胞中的表达水平检测

2．1 实验材料

2．1．1 临床样本

2．1．2 细胞

2．1．3 抗体与主要试剂

2．1．4 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 免疫组织化学染色实验

2．2．3 Western Blotting

2．2．3 实时荧光定量PCR实验

2．2．4 数据分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 FOXM1在癌组织中的蛋白表达水平检测

2．3．2 FOXM1在肿瘤细胞中的表达水平检测

2．4 小结

第3章 重组腺病毒AdFOXM1shRNA的制备及检测

3．1 实验材料

3．1．1 细胞培养

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 重组腺病毒的大量制备

3．2．2 重组腺病毒的纯化

3．2．3 A260紫外吸收法测病毒颗粒数

3．2．4 TCID50法检测病毒滴度

3．2．5 RCA检测

3．2．6 病毒感染实验

3．2．7 X-gal染色实验

3．2．8 Western Blotting

3．2．9 数据分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 重组腺病毒AdFOXM1shRNA的质量检测

3．3．2 重组腺病毒AdLacZ在肿瘤细胞中的感染效率

3．3．3 重组腺病毒AdFOXM1shRNA在细胞中对FOXM1的干扰效果

3．4 小结

第4章 FOXM1对肿瘤细胞增殖的影响

4．1 实验材料

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 脂质体转染实验

4．2．2 半定量RT-PCR

4．2．3 细胞计数

4．2．4 Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡

4．2．5 流式检验细胞周期

4．2．6 数据分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 干扰FOXM1的表达降低了细胞周期相关基因的表达水平

4．3．2 AdFOXM1shRNA能有效抑制肿瘤细胞的增殖

4．3．3 FOXM1的缺失对细胞凋亡的影响

4．3．4 FOXM1的缺失对细胞周期的影响

4．4 小结

第5章 AdFOXM1shRNA对肿瘤发生的影响

5．1 实验材料

5．1．1 实验动物

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要实验仪器

5．2 实验方法

5．2．1 软琼脂克隆形成实验

5．2．2 动物模型的建立

5．3 结果与讨论

5．3．1 AdFOXM1shRNA在体外对肿瘤细胞形成克隆能力的影响

5．3．2 AdFOXM1shRNA在体内对肿瘤细胞成瘤能力的影响

5．4 小结

第6章 AdFOXM1shRNA对肿瘤生长的影响

6．1 实验材料

6．1．1 实验动物

6．1．2 主要试剂

6．1．3 主要实验仪器

6．2 实验方法

6．2．1 裸鼠肿瘤模型的建立

6．2．2 Western Blotting

6．2．3 半定量RT-PCR

6．2．4 石蜡切片制作

6．2．5 石蜡切片HE染色

6．2．6 免疫组织化学染色实验

6．2．7 数据分析

6．3 结果与讨论

6．3．1 AdFOXM1shRNA能抑制CNE细胞移植瘤的生长

6．3．2 AdFOXM1shRNA能抑制ZR-75-30细胞移植瘤的生长

6．4 小结

结论

参考文献

附录A 常用缓冲液和试剂配方

附录B 攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢