真菌GDH在提高农作物氮素利用率上的应用研究

摘要

氮是植物生长发育所必须的大量元素，同时也是农业生产上大量应用的元素之一。适当的氮肥施用可以提高农作物的产量和质量，增加经济效益。但与此同时，氮肥的施用也会引发一系列的环境和经济问题，比如淋失的氮素流入水体或通过氧化进入空气，造成水体富营养化或温室效应等。当下，氮污染已经成为一种全球性的污染，威胁着整个生态系统的正常运行。
　　 谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase，GDH)是一种催化NH4+和α-酮戊二酸合成谷氨酸或其逆反应的酶，在生物的氮循环代谢途径中起着重要的作用。本论文下载了NCBI和Uniprot这两个数据库中所有的真菌蛋白序列（约200万条），然后从中鉴定了178个菌株的295个GDH，此外还有15条序列由福建农林大学提供。后续的分析表明，所有真菌GDH可以分为两个亚家族:其中一个亚家族分子量大小约为120KDa，以NADH为辅酶，功能偏向于分解谷氨酸;另一个亚家族分子量大小约为50KDa，以NADPH为辅酶，主要参与谷氨酸的合成。在两类GDH中，分子量小的亚家族和大肠杆菌的NADPH依赖GDH在蛋白结构（包括一级、二级和三级结构）和活性位点上均有高度的相似性，由此推测该亚家族GDH和大肠杆菌NADPH依赖GDH一样，具有高效的同化氮素的潜能。
　　 为验证生物信息学分析结果，一个源自真菌Alternaria brassicicola的GDH被选为代表做实验分析。体外实验表明，该酶对NH4+、α-酮戊二酸和谷氨酸的Km值分别为2.144mM、2.690mM和96.772mM，可见该酶具有高效合成谷氨酸的潜能。此外，编码该酶的基因被过表达到水稻中。在高氮条件下，转基因水稻幼苗和野生型的生长情况无显著差异;但在低氮条件下，转基因植株在株高、干重和氮含量上均优于野生型。由此可见，该基因的过表达可以提高水稻的氮素利用率。
　　 综上所述，真菌小分子量亚家族GDH是一类具有高效同化氮素潜能的酶，可作为改造作物氮素同化途径、提高作物氮素利用率的候选工程蛋白。

目录

声明

摘要

插图索引

缩略词

第1章 绪论

1．1 氮素利用现状及污染情况

1．2 提高作物氮素利用率的策略

1．2．1 绿肥的使用

1．2．2 施肥策略的选择和优化

1．2．3 分子育种方法提高作物氮素利用率的尝试

1．2．4 其他提高植物氮素利用率的方法

1．3 谷氨酸脱氢酶的结构和功能特点

1．3．1 GDH的空间结构特点

1．3．2 GDH辅酶结合位点的特点

1．3．3 GDH的功能特点

1．3．4 GDH在提高植物氮素利用率上的应用

1．4 生物信息学在基因预测功能上的应用

1．5 本论文的设计思路及意义

第2章 真菌GDH家族蛋白的生物信息学分析

2．1 材料和方法

2．1．1 真菌蛋白序列的下载及预处理

2．1．2 真菌GDH的筛选和鉴定

2．1．3 序列联配及进化树构建

2．1．4 三级结构预测及蛋白活性位点分析

2．2 结果和讨论

2．2．1．真菌GDH的分类及分布情况

2．2．2．真菌GDH的结构比较分析

2．2．3．真菌GDH的活性位点分析

2．3 本章小结

2．3．1 真菌GDH的结构特点

2．3．2 真菌GDH辅酶偏好性分析

2．3．3 真菌GDH的催化位点分析

第3章 AbGDH的原核表达和酶促动力学分析

3．1 材料和方法

3．1．1 真菌A．brassicicola的培养

3．1．2 AbGDH基因的克隆

3．1．3 原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

3．1．4 AbGDH的酶促动力学分析

3．2 结果和讨论

3．2．1 AbGDH基因的获得

3．2．2 原核表达载体的构建及His6-TF-AbGDH融合蛋白的表达

3．2．3 融合蛋白的纯化及检测

3．2．4 AbGDH酶学性质的测定

3．3 本章小结

3．3．1 AbGDH基因的克隆

3．3．2 AbGDH的原核表达

3．3．3 AbGDH的酶学特性测定

第4章 过表达AbGDH基因对水稻氮素利用率的影响

4．1 材料和方法

4．1．1 植物过表达载体的选择

4．1．2 Ubi：：AbGDH过表达载体的构建

4．1．3 植物转化及转基因水稻的获得

4．1．4 转基因水稻T-DNA拷贝数鉴定及纯合子筛选

4．1．5 潮霉素抗性基因检测

4．1．6 AbGDH基因的过表达检测

4．1．7 转基因水稻幼苗的氮素利用率测定

4．2 结果和讨论

4．2．1 植物过表达载体构建

4．2．2 水稻转化

4．2．3 T-DNA拷贝数鉴定及转基因植株纯合子筛选

4．2．4 转基因水稻的分子检测

4．2．5 转基因水稻幼苗氮素利用率分析

4．3 本章小结

4．3．1 植物过表达载体的构建

4．3．2 水稻转化

4．3．3 转基因水稻的筛选及分子检测

4．3．4 转基因水稻幼苗氮素利用率分析

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

附录B 真菌GDH系统进化树

附录C Group S和Group L系统进化树及motifs分布图

附录D 本论文所使用的计算机程序

附录E 本论文中所有真菌GDH的基本信息

附录F AbGDH及其相关序列信息

附录G 水稻转化所用培养基配方

附录H 水稻氮梯度水培养营养液配方

致谢