新型载铁体传感器的构建及应用于结核分枝杆菌的快速检测

摘要

由结核分枝杆菌感染所引起的结核病仍然是目前全球范围内引起死亡率最高的疾病，每年会有大约180万人死于结核病。尽管在最为发达的几个国家中，结核病发生的概率非常低，但在经济落后的国家，特别是非洲国家与东南亚国家，结核病仍然属于高发病。结核分枝杆菌生长十分缓慢，导致临床诊断的周期相比于其他病原菌更长。同时由于治疗过程中的不合理用药，导致结核耐药菌株的出现。所以，目前迫切需要快速诊断结核及结核致病性的有效方法，以利于结核病的早期诊断和合理用药。结核的生长和致病依赖于铁的摄取，结核分支杆菌在生长过程中不断向胞外分泌载铁体，捕获人体中含铁蛋白中铁离子，载铁体结合铁后再回到细胞壁上将铁离子传递到胞内，这是结核摄取铁的关键。本文致力于建立结核病相关检测的新方法，实现结核病的快速诊断。主要研究工作如下:
　　1.新型载铁体阻抗传感器的构建及应用。首次构建了一种载铁体的电化学检测新方法，基于载铁体对于病原菌生长与致病的重要意义，通过检测载铁体反映活性病原菌的浓度。载铁体与氯化血红素会结合形成紧密复合物，将氯化血红素修饰于电极，电极上载铁体-氯化血红素复合物的形成会引起电极表面电导发生改变，利用交流阻抗谱分析电极上载铁体与氯化血红素反应前后造成的电导的变化情况，构建载铁体阻抗传感器。通过优化氯化血红素的修饰时间和氯化血红素与载铁体相互作用时间进一步加强传感器对于载铁体的响应。利用叉指阵列微电极技术提升电极材料的性能，扩大方法的灵敏度。同时分析了病原菌培养基成分对于传感器响应的影响，证明培养基成分对检测干扰较小。该方法实现了载铁体的快速定量检测，线性范围为1nM-100μM,检测时间只需15min，检测下限为0.86nM。该法与常见铬天青S显色法及高氯酸铁法等相比更加简单、快速、灵敏，有望应用于临床病原菌的诊断和药物治疗。
　　2.载铁体压电传感器的构建及应用于结核分枝杆菌的检测。结核分泌的载铁体与能与血红素结合，因此结核生长过程中，能够引起修饰了氯化血红素的叉指电极的电极表面的电导显著改变。串联式压电传感器是由插入检测池的金属对电极与压电石英晶体构成，对电极间电导与电容等电参数的有灵敏响应。多通道串联压电传感器在此基础上建立了多样本的实时在线监测。将修饰的氯化血红素的叉指阵列微电极连接多通道串联压电传感器，电极电导的变化引起压电石英晶体频率的响应，以此检测结核分枝杆菌生长过程中分泌的载铁体，构建了新型载铁体压电传感器。该方法能够在10min内完成检测，检测下限为0.81μM。该方法应用于活菌的检测，能检测到最低102cfu/mL浓度的活菌。
　　3.基于载铁体探针的压电传感器检测结核分支杆菌方法的构建。细菌向外分泌的载铁体结合铁之后能够与细菌表面的载铁体受体相结合，将含铁的载铁体修饰于叉指阵列微电极，以捕获细菌，使细菌覆盖在电极表面，对细菌聚集于电极表面所引起电参数变化进行分析，构建了结核分枝杆菌的定量检测。该方法建立于叉指电极-串联压电传感器检测平台的基础之上，利用压电传感技术高灵敏度、操作简单、实时在线监测等优点实现了快速、灵敏、简单的结核分枝杆菌检测。该方法能够检测到最低104cfu/mL的活菌。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 研究背景与意义

1．2 结核病诊断研究现状和文献综述

1．2．1 痰样镜检

1．2．2 培养法

1．2．3 分子生物学办法

1．2．4 免疫学检测

1．3 载铁体在细菌检测中的意义与研究进展

1．3．1 载铁体的结构与功能

1．3．2 载铁体的分析与检测

1．3．3 载铁体探针应用于细菌检测

1．4 压电传感技术的进展

1．4．1 压电传感器原理和构建

1．4．2 串联式压电传感器及应用

1．5 叉指阵列电极研究及应用

1．5．1 叉指阵列电极简介

1．5．2 叉指阵列微电极的应用

1．6 论文构思与展望

第2章 新型载铁体阻抗传感器的构建

2．1 前言

2．2 实验部分

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器和电极

2．2．3 氯化血红素修饰叉指电极

2．2．4 样品的检测

2．3 结果讨论

2．3．1 修饰叉指电极的阻抗表征结果

2．3．2 载铁体传感器的传感原理与典型响应曲线

2．3．3 影响载铁体传感器阻抗响应的因素

2．3．4 标准曲线的绘制

2．4 培养基溶液中载铁体回收率的检测

2．5 小结

第3章 载铁体压电传感器的构建及应用于结核分枝杆菌的快速检测

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 试剂

3．2．2 菌种

3．2．3 标准溶液的配制

3．2．4 活菌样品制备

3．2．5 传感器的构建

3．2．6 氯化血红素修饰叉指电极的拉曼表征

3．2．7 样本的检测

3．3 结果与讨论

3．3．1 氯化血红素修饰叉指电极的拉曼表征结果

3．3．2 氯化血红素叉指电极压电传感器的工作原理

3．3．3 传感器对载铁体的典型响应曲线

3．3．4 去铁胺标准溶液的检测

3．3．5 活菌样本检测

3．3．6 小结

第4章 载铁体探针-压电传感器快速检测结核分枝杆菌

4．1 前言

4．2 实验部分

4．2．1 试剂与菌种

4．2．2 仪器与电极材料

4．2．3 载铁体修饰叉指金电极

4．2．4 传感器检测步骤

4．3 结果与讨论

4．3．1 去铁胺修饰叉指金电极的拉曼表征结果

4．3．2 细菌吸附效果扫描电镜表征结果

4．3．3 传感器原理及对活菌的典型响应曲线

4．3．4 传感器检测不同浓度细菌的响应曲线

4．4 小结

结论

参考文献

致谢

附录A 本文作者相关论文题录