柠檬醛、柠檬烯和薄荷醇对铜绿微囊藻的生长及产毒的影响

摘要

淡水蓝藻细菌能合成许多毒性较强的毒素，因而对生态环境造成恶劣影响。铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）是一种广泛分布的产毒蓝藻，能够合成许多水溶性的有害有机物。在本文中，重点研究了柠檬醛、柠檬烯和薄荷醇对铜绿微囊藻的生长以及对微囊藻毒素（Microcystin，MCs）浓度的影响。测定了在连续培养的120h内，铜绿微囊藻细胞数量（Cell density）、干重(Dry weight）、叶绿素a（Chlorophyll-a，chl-a）、藻蓝蛋白（Phycocysnin，PC）、别藻蓝蛋白（Allophycocyanin，APC）的含量，酯酶（Esterase）、脱氢酶（Dehydrogenase）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），过氧化物酶（Peroxidase， POD），过氧化氢酶（Catalase，CAT）的活性，丙二醛（Malondialdehyde， MDA）的含量以及细胞内和细胞外MCs的含量的变化。
　　在对照组中，处于稳定期的样本的细胞数量和细胞干重均没有发生显著的变化，而处于对数期的样本的细胞数量和细胞干重则快速增长。细胞内光和色素的含量也随着细胞数量的变化而变化。酯酶活性（Esterase avtivity，EA），脱氢酶活性（Dehydrogenase activity，DHA）和抗氧化酶的活性在120h的连续培养中并未发生显著的变化（p>0.05），处于稳定期的样本的细胞内的MCs含量在120h连续培养中未检测到显著变化，而细胞外MCs含量则逐渐升高，时值对数期的样本细胞内MCs的含量则快速升高，而细胞外的MCs含量则变化不明显。
　　在柠檬醛的胁迫下，铜绿微囊藻细胞的数量不断减少，当初始细胞数量为1.3×107，1.1×106和2.9×105cell·mL1时，细胞数量在5d内净减少量分别为3.1，4.4和5.0log。而细胞干重在120h连续培养之后降低至0.07，0.002和0.001mg·L?1，说明柠檬醛能够有效地抑制铜绿微囊藻的生长。细胞内的chl-a，PC和APC的含量亦在培养过程中出现了逐步的降低。经过36h的连续培养后，chl-a的含量下降至0.8，0.06和0.008mg·mL1；PC的含量也出现了明显的下降，在24h的连续培养之后，PC的含量降低至0.5，0.03和0.009μg·mL?1。APC的含量也有相同的变化趋势，经过36h的连续培养之后，APC的含量降低至0.03，0.001和0.0006μg·mL?1。这说明光合作用的效率在柠檬醛的胁迫下不断降低。细胞活力是通过测定酯酶活性（EA）和脱氢酶活性（DHA）来确定的。在经过120h的连续培养之后，加入柠檬醛的样本的EA降低为对照组的3％以下，而DHA则降低至不及对照组的2%，说明了在柠檬醛的胁迫下，细胞活性明显降低。抗氧化酶的活性也出现了类似的变化，72h连续培养之后，SOD的活性降低至5.4U·mgprot?1(p<0.05)，POD和CAT的活性降低至2.0和1.2U·mgprot?1(p<0.05)，而平均MDA的含量则上升至约为27fmol·cell?1，说明在柠檬醛的胁迫下，抗氧化酶的活力显著降低，同时细胞过氧化程度加剧，这可能是导致铜绿微囊藻细胞死亡的一个原因。
　　柠檬醛对MCs的释放也有着明显的影响，在柠檬醛的胁迫下，细胞数量的增长受到抑制，因此在培养液中总MCs的含量的增长亦受到抑制，而细胞内MCs则逐步地释放至细胞外。120h的连续培养之后，细胞内的MCs的含量降低至0.24，0.01和0.001μg·L?1，而细胞外的MCs的含量则相应地出现升高，这个现象说明了MCs是一种在细胞内合成，当细胞死亡时释放的物质。平均细胞内MCs含量则变化不明显，在0时刻为25fg·cell?1，在120h的连续培养之后为23fg·cell?1，说明MCs并不能随意地穿过活细胞的细胞膜。此外，细胞外的MCs含量并未出现显著的降低，说明在柠檬醛并不能促使MCs分解。
　　在柠檬烯的胁迫下，细胞数量逐步下降，当初始细胞数量为1.3×107，1.1×106和2.9×105cell·mL?1时，其连续培养5日后的净减少量为3.1，3.6和3.8log。此时细胞干重则降低至0.07，0.002和0.001mg·L?1，相较于对照组而言差别显著（p<0.05），光和色素的含量亦出现明显的降低。同时，EA和DHA也出现明显的下降，当初始细胞数量为1.3×107，1.1×106和2.9×105cell·mL?1时，经过48h的连续培养，EA降低至对照组的71%，30%和44%，而DHA降低至对照组的67%，35%和56%。这说明细胞活性在柠檬烯的胁迫下显著降低。抗氧化酶的活性也呈现逐渐下降的趋势，在48h的连续培养之后，SOD的活性降低至11U·mgprot?1，POD的活性降解至3.9U·mgprot?1，而CAT的活性降低至1.5U·mgprot?1，与此同时，平均MDA的含量却逐步上升，说明抗氧化酶的活性在细胞死亡之前就逐渐降低，之后细胞膜脂质过氧化程度便逐渐加剧。
　　柠檬烯对铜绿微囊藻细胞合成以及释放MCs的影响也是显著的，藻细胞在柠檬烯的胁迫下数量不断减少，而MCs的总量因此保持恒定。而细胞内的MCs的含量逐步下降，细胞外的MCs的含量逐步上升，说明藻细胞在死亡时将在细胞内合成的MCs逐渐释放至细胞外。而经历了120h的连续培养之后，MCs的总量并未出现显著的变化，说明柠檬烯并不能促使MCs分解。
　　在薄荷醇的胁迫下，铜绿微囊藻细胞的数量亦出现逐渐下降的趋势，当初始细胞数量为1.3×107，1.1×106和2.9×105cell·mL?1时，经过120h的连续培养，细胞的净减少量为2.2，3.0和3.4log，而细胞干重亦随之出现下降，降至0.07，0.002和0.001mg·L-1。细胞内光和色素的含量亦呈降低趋势，并且变化显著。细胞活性在薄荷醇的胁迫下不断降低，当初始细胞数量为1.3×107，1.1×106和2.9×105cell·mL?1时，经过36h的培养，EA降低至对照组的67%，55%和60%（p<0.05），而经历60h的连续培养后，DHA则降低至对照组的65%，44%和74%（p<0.05）。抗氧化酶的活性在薄荷醇的胁迫下出现缓慢下降，48h后SOD的活性降低至9.3U·mgprot?1（p<0.05），而POD的活性降低至2.1U·mgprot?1（p<0.05），CAT的活性降低至1.8U·mgprot?1（p<0.05），但是平均MDA含量却并未出现显著的变化（p>0.05），经过120h的连续培养，平均MDA的含量升高为8.3fmol·cell?1。相交于0时刻的6.0fmol·cell?1而言，变化并不显著。一现象说明抗氧化酶的活性会随着细胞的活性降低而受到影响，但并不会直接受到薄荷醇的影响，铜绿微囊藻细胞在死亡之后裂解，因此在活细胞中平均MDA的含量并未出现显著的升高。
　　薄荷醇对MCs的合成和释放的影响也是显著的，因为在薄荷醇的胁迫下，细胞的生长受到抑制，因此MCs的总量变化并不显著，而随着细胞的死亡，细胞内的MCs逐渐释放至细胞外，导致细胞内MCs的含量出现显著的降低，而细胞外MCs的含量则明显升高。平均细胞内的MCs的含量则保持不变而细胞外MCs的含量却并未出现显著的降低，说明薄荷醇亦无法促使MCs的降解。

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附 表 索 引

第1章 绪 论

1.1. 水体富营养化和微囊藻过度繁殖的成因

1.2. 铜绿微囊藻概述

1.3. 微囊藻毒素的危害

1.4. 藻类污染控制技术研究进展

1.5. 微囊藻毒素污染控制技术研究进展

1.6. 研究背景、内容和目的

2. 第2章 柠檬醛，柠檬烯和薄荷醇抑藻效应的研究

2.1. 引言

2.2. 材料与方法

2.3. 实验结果

2.4. 讨论

2.5. 本章小结

3. 第3章 柠檬醛、柠檬烯和薄荷醇抑藻机理的研究

3.1. 引言

3.2. 材料与方法

3.3. 实验结果

3.4. 讨论

3.5. 本章小结

第4章 细胞内外微囊藻毒素含量变化

4.1. 引言

4.2. 材料和方法

4.3. 实验结果

4.4. 讨论

4.5. 本章小结

结论

研究展望

参考文献

附录A 攻读博士学位期间所发表的学术论文目录

致谢