安络小皮伞的发酵工艺优化与药效学研究

摘要

目的:分离筛选安络小皮伞高产菌株;对筛选得到的安络小皮伞菌株进行生物学特征研究，掌握其菌丝体生长、繁殖所需的营养条件及环境条件;测定安络小皮伞子实体、菌丝、发酵液、固体发酵物中化学成分含量，为其质量评价奠定基础;研究安络小皮伞菌丝、发酵物对偏头痛的镇痛作用及镇痛机制，对比菌丝、固体发酵物对偏头痛的镇痛作用，探讨菌丝体代替固体发酵物作为药用的可行性;研究安络小皮伞菌丝、固体发酵物对急性肺损伤小鼠的保护作用，探究安络小皮伞新的治疗功效。
　　方法:采用自然选育的方法优选安络小皮伞的高产菌株。采用固体斜面考察法，通过单因素考察和正交实验探究不同营养条件和环境条件对安络小皮伞菌丝生长的影响，优化出碳源、氮源、微量元素的比例。采用液体摇瓶法，通过单因素考察和正交实验优化液体发酵工艺，确定碳源、氮源、微量元素的比例。采用DNS法测定安络小皮伞各部位多糖含量;采用HPLC法测定安络小皮伞各部位麦角甾醇含量;采用考马斯亮蓝法测定安络小皮伞各部位蛋白质含量。采用硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠模型，用硝酸还原酶法测定血清中NO，ELISA法测定IL-6、IL-1β、5-HT、DA、NE含量，Western blot分析脑组织中JAK2、STAT3和NF-κ B表达情况，研究安络小皮伞菌丝、固体发酵物对于偏头痛大鼠的镇痛作用及镇痛机制。采用脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠模型，ELISA法测定肺组织中SOD、MDA及血清中SOD、MDA、IL-6、TNF-α含量，研究安络小皮伞菌丝、固体发酵物对急性肺损伤的保护作用。
　　结果:经过分离、纯化得到高产菌株AL1，菌丝洁白，粗壮，长势好，抗性强。斜面培养优化结果为:蔗糖2％、麦麸1.5％、MgSO40.1％、KH2PO40.15％，安络小皮伞在pH5-6均能以较快速度生长，最适pH是6，菌丝生长在pH大于7时受阻，大于8时停止生长。液体深层培养优化结果为:玉米粉4％、蛋白胨0.3％、MgSO40.1％、KH2PO40.1％，当pH5.5-6.5时;摇瓶最佳装量装量为120ml/250m1;最佳接种量为4块/250ml。含量测定结果为安络小皮伞发酵液多糖平均含量335.6mg/g，菌丝多糖平均含31.9mg/g，固体发酵物多糖平均含量39.3mg/g，子实体中多糖平均含量47.6mg/g。安络小皮伞菌丝中麦角甾醇平均含量为0.394mg/g，固体发酵物中麦角甾醇平均含量为0.310mg/g，子实体中麦角甾醇平均含量为0.208mg/g。安络小皮伞子实体蛋白质平均含量2.595mg/g，菌丝平均含量0.845mg/g，固体发酵物平均含量1.935mg/g。偏头痛实验结果表明，安络小皮伞固体发酵物和菌丝的乙醇提取物对偏头痛大鼠有镇痛作用，其中固体发酵物效果优于菌丝。安络小皮伞固体发酵物和菌丝，对急性肺损伤小鼠起到保护作用，其中固体发酵物效果明显。
　　结论:通过优选高产菌株，优化液体发酵工艺，为之后的安络小皮伞菌丝工业化生产提供基础;通过测定子实体、菌丝、固体发酵物的多糖、麦角甾醇、蛋白质成分含量，为其质量评价提供依据;偏头痛实验中，安络小皮伞固体发酵物、菌丝通过调节炎症因子和神经递质含量，从而调节血管的收缩和舒张对偏头痛大鼠产生镇痛作用，对比菌丝、固体发酵物的治疗效果，两者都有明显的镇痛作用，验证了菌丝代替固体发酵物药用的可行性。安络小皮伞固体发酵物能够抑制肺组织内的细胞膜过氧化，调节炎症因子含量和氧化应激反应，减轻细胞损伤，从而对急性肺损伤小鼠起到保护作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

文献综述

第一章 安络小皮伞菌种的采集、分离纯化及生物学特性研究

1．1 安络小皮伞新菌株的分离、纯化

1．2 菌种复栽试验

1．3 安络小皮伞菌种的生物学特性研究

1．3．1 供试菌株与试剂

1．3．2 实验方法

1．3．3 结果与讨论

1．3．4 讨论

第二章 安络小皮伞菌种液体深层发酵工艺研究

2．1 实验材料

2．1．1 实验仪器

2．1．2 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 斜面菌种培养

2．2．2 液体菌种培养

2．2．3 液体深层发酵工艺考察

2．3 结果与讨论

2．3．1 碳源考察

2．3．2 氮源考察

2．3．3 微量元素考察

2．3．4 正交优化实验

2．3．5 环境因素的影响

2．3．6 讨论

第三章 安络小皮伞不同部位及发酵产物中多糖、麦角甾醇、蛋白质含量测定

3．1 DNS法测定安络小皮伞子实体、菌丝、发酵液及固体发酵物中的多糖含量

3．1．1 仪器与材料

3．1．2 测定方法

3．1．3 方法学考察

3．1．4 样品多糖含量测定结果

3．1．5 讨论

3．2 安络小皮伞子实体、菌丝及固体发酵物的麦角甾醇含量的测定

3．2．1 仪器与材料

3．2．2 测定方法

3．2．3 方法学考察

3．2．4 样品含量测定结果

3．2．5 讨论

3．3 安络小皮伞子实体、菌丝、固体发酵物中蛋白质含量测定

3．3．1 仪器与材料

3．3．2 样品的制备

3．3．3 测定方法

3．3．4 方法学考察

3．3．5 样品含量测定结果取

3．3．6 讨论

第四章 安络小皮伞不同部位药理活性的研究

4．1 安络小皮伞菌丝、固体发酵物对偏头痛大鼠镇痛作用的实验研究

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．1．3 实验结果

4．1．4 讨论

4．2 安络小皮伞菌丝、固体发酵物对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤的保护作用

4．2．1 材料与仪器

4．2．2 材料与试剂

4．2．3 实验方法

4．2．4 实验结果

4．2．5 讨论

总结和讨论

致谢

参考文献

附录