氧化石墨烯荧光探针用于核酸酶的热动力学分析和药物筛选

摘要

生物分子的快速检测是现代生物医学和分析化学领域的重要研究课题之一。与一些成本高，实验过程冗杂的传统生物技术相比，荧光分子探针技术是一种成本低廉、灵敏度高、特异性强，操作简单的研究手段。它能将检测的复杂生物分子信息转变为易于检测的荧光信号，因此被广泛地应用于各种生物分子如蛋白质、核酸、酶等的快速检测中。然而，现有的荧光探针技术在应用中存在一些缺陷:如荧光体系的背景信号高、所用材料的生物相容性差、实验结果欠稳定等。因此进一步改进和发展新型荧光分子探针技术具有极其重要的应用价值。
　　近年来，科学家们发现氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)作为一种通用荧光淬灭剂具有吸附单链核酸的能力，此外，吸附于GO表面的功能核酸分子具有较高的细胞转染效率、低细胞毒性以及较强的生物稳定性。因此，GO结合荧光分子探针技术可以降低背景信号、改善生物相容性、提高灵敏度等，从而被广泛应用于细胞内特定基因及代谢物的检测和成像等生命活动。
　　本文将GO与核酸酶本身固有的生物学特性相结合，利用氧化石墨烯荧光探针技术开展了一系列快速，简单，高特异性的核酸酶活性与动力学分析以及抑制剂的体内外筛选研究。
　　本文的主要研究内容如下:
　　1.基于氧化石墨烯荧光技术用于绿豆核酸酶热动力分析和抑制剂的筛选
　　基于绿豆核酸酶诱导单链DNA断裂以及氧化石墨烯对不同长度的单链DNA亲和力不同而设计了基于荧光探针技术对绿豆核酸酶的定量定性分析实验。在通优化的酶促反应条件下，绿豆核酸酶线性检测范围为2×10-4-4×10-2 unit/mL，检测下限为1×10-4 unit/mL，最适GO浓度为15μg/ml，体系的最适酶反应浓度为8×10-2unit/mL，在37℃下反应30min最为合适。该方法进一步用于考察不同抗生素和重金属离子对酶活力的影响。其检测结果得到了琼脂糖凝胶电泳法的验证。这种灵敏度高的检测方法适合绿豆核酸酶体内、外的定量定性分析。有趣的是，我们发现:抑制绿豆体内核酸酶活性可导致抑制绿豆芽的生长。
　　2.基于氧化石墨烯荧光技术对脱氧核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)的活性分析
　　DNaseⅠ是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡核苷酸，本章利用氧化石墨烯这种通用淬灭剂对不同长度DNA亲和力不同的特点以及荧光分子探针技术选择性高，灵敏度高，操作简易的优点来开展DNaseⅠ的热动力分析以及体内外抑制剂的筛选。本文从多种不同的单链或双链荧光分子探针中筛选得到了信背比最高的探针，进一步将其用于DNaseⅠ的定量分析。在优化检测条件下，得到DNaseⅠ酶浓度的范围为1×10-4到6×10-2 unit/mL，检测下限为0.5×10-4 unit/mL。开展进一步研究DNA酶Ⅰ活性抑制剂筛选结果发现:庆大霉素和卡那霉素具有抑制DNA酶Ⅰ活性的能力，红霉素为激活剂;AS3+、Pb2+、Cu2+、Hg2+、Cd2+能抑制酶活性，而Mg2+和Mn2+作用效果相反。该方法还被用于肿瘤和血清中的DNA酶Ⅰ定量定性检测，结果表明:该方法可用于1μg总蛋白中的DNaseⅠ活性检测。
　　3.GO-嵌合核酸荧光探针用于RNase H活性分析方法的建立及其应用
　　本章以DNA-RNA异源双链核酸探针作为酶促底物和信号报告分子，结合氧化石墨烯猝灭荧光的能力建立一种RNase H活性分析方法，将其用于RNase H的热动力学考察以及RNase H的抑制剂筛选。结果表明这种RNase H活性检测线性区间为1.0×10-4-4.0×10-2unit/mL，检测下限可以达到0.5×10-4 unit/mL;抑制剂筛选结果发现庆大霉素、链霉素以及Hg2+等重金属离子均能显著抑制RNase H活性。最后将该方法用于微量复杂生物样品中的RNase H表达水平分析。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 荧光分析技术的概述

1．2 荧光探针技术的研究现状

1．2．1 荧光探针技术的概述

1．2．2 荧光探针技术的原理与探针种类

1．2．3 荧光探针技术的应用及发展

1．3 生物传感器的概述

1．3．1 生物传感器简介及其结构

1．3．2 荧光生物传感器的发展

1．4 石墨烯的概述

1．4．1 石墨烯简介及制备

1．4．2 石墨烯的应用

1．4．3 基于氧化石墨烯的荧光探针技术

1．5 本文的选题背景和研究意义

1．6 本文拟开展的工作

第2章 基于GO-荧光探针技术用于MBN的检测与分析

2．1 前言

2．2 实验准备部分

2．2．1 基于氧化石墨烯分子探针技术检测绿豆酶的实验原理

2．2．2 试剂与仪器

2．3 实验方法部分

2．3．1 溶液的配制与实验材料及其器皿的准备

2．3．2 荧光强度测定的方法

2．3．3 绿豆核酸酶的可行性分析以及添加顺序的考察

2．3．4 GO淬灭荧光效率的考察

2．3．5 绿豆核酸酶动力学的研究

2．3．6 绿豆核酸酶抑制剂的筛选

2．3．7 银染的方法验证实验的准确性

2．3．8 绿豆芽培养

2．3．9 绿豆芽细胞裂解液的提取

2．3．10 蛋白质浓度的测定

2．3．11 细胞提取液的检测

2．4 结果与讨论

2．4．1 可行性分析

2．4．2 GO浓度的优化

2．4．3 酶浓度的优化以及反应时间的优化

2．4．4 底物浓度对酶促反应影响

2．4．5 MNB的动力学曲线的建立

2．4．6 抑制剂的筛选

2．4．7 金属离子对MBN活力的影响

2．4．8 绿豆芽的培育以及抑制剂的筛选

2．4．9 荧光法检测绿豆芽提取物中MBN

2．5 小结

第3章 基于GO-荧光探针技术用于DNase Ⅰ的定量分析

3．1 前言

3．2 实验准备部分

3．2．1 基于GO-荧光探针技术检测DNase Ⅰ活性的实验原理

3．2．2 仪器和试剂

3．3 实验方法部分

3．3．1 溶液的配制与实验器皿的处理

3．3．2 荧光强度测定的方法

3．3．3 DNase Ⅰ的可行性分析以及添加顺序的考察

3．3．4 GO淬灭荧光效率的考察

3．3．5 DNase Ⅰ热动力学的研究

3．3．6 DNase Ⅰ抑制剂的筛选

3．3．7 银染的方法验证实验的准确性

3．3．8 肿瘤细胞的培养与处理方法

3．3．9 检测复杂样品中的DNase Ⅰ的活性

3．4 结果与讨论

3．4．1 不同荧光探针对DNase Ⅰ检测的信背比考察

3．4．2 关于GO淬灭效率的考察

3．4．3 酶体系实验以及反应时间的优化

3．4．4 酶的热动力学分析

3．4．5 抗生素对DNase Ⅰ活力的影响

3．4．6 金属离子的筛选以及浓度条件的考察

3．4．7 结晶紫对DNase Ⅰ的影响考察

3．4．8 胃癌细胞以及胶质瘤细胞组织样品的检测

3．4．9 血清样品中DNase Ⅰ活性检测

3．5 小结

第4章 基于GO-荧光探针的RNase H活性分析方法建立及其应用

4．1 前言

4．2 实验准备部分

4．2．1 实验设计原理

4．2．2 试剂与仪器

4．3 实验方法部分

4．3．1 荧光检测

4．3．2 溶液的配制与实验器皿的处理

4．3．3 RNase H活性实验

4．3．4 RNase H的可行性分析以及添加顺序的考察

4．3．5 GO淬灭荧光效率的考察

4．3．6 RNA酶H热动力学的研究

4．3．7 RNase H抑制齐0的筛选

4．3．8 肿瘤细胞的培养与处理方法

4．3．9 银染的方法验证实验的准确性

4．3．10 检测复杂样品中的RNase H的活性

4．4 结果与讨论

4．4．1 得到信噪比比较高的探针

4．4．2 GO优化以及淬灭效率的考察

4．4．3 酶浓度的优化

4．4．4 反应时间的优化

4．4．5 RNase H的热动力学研究

4．4．6 金属离子对RNase H活性的影响

4．4．7 RNase H抑制剂的筛选

4．4．8 细胞样品和血清样品RNase H含量的测定

4．5 小结

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间参与发表论文和专利

致谢