拟南芥转录因子TCP2与CRY1相互作用的遗传学与生化分析

摘要

光通过多种光受体调节植物的生长发育，这些光受体包含光敏色素与隐花色素。拟南芥隐花色素CRY1(CRYPTOCHROME1)作为蓝光信号受体蛋白，已有许多的研究报道了其在植物蓝光信号转导途径方面的功能，如抑制下胚轴的伸长，控制幼苗的去黄化、生物钟节律，促进植物花青素的积累，影响叶片形态和开花时间等。CRY1蛋白通过与其下游的信号蛋白相互作用，启动蓝光信号的传递，从而促进植物光形态的建成。目前光受体调节光形态建成的机制已得到广泛的研究，但是拟南芥隐花色素CRY1调节光形态建成的信号传导机制目前仍不清楚。研究发现了许多参与CRY1蓝光信号转导并相互作用的蛋白，但转录因子蛋白参与CRY1蓝光信号通路的研究报道目前几乎没有。为了更好地了解和完善CRY1蓝光信号转导机制，本研究通过酵母双杂交的方法，用CRY1作为诱饵筛选转录因子酵母库，获得与CRY1相互作用并可能介导CRY1参与拟南芥光形态建成的转录因子蛋白。具体研究结果如下:
　　通过多次的酵母双杂交(yeast two hybrid assay)试验反复验证以及双分子荧光互补BiFC（Bimolecular Fluorescence Complementation assay）和免疫共沉淀 co-IP(co-immunoprecipitation)试验的进一步验证，证明CRY1与初步筛选到的转录因子蛋白TCP2(TEOSINTE-LIKE1, CYCLO IDEA, and PROLIFERATING CELL FACTOR2)相互作用。通过烟草和拟南芥中亚细胞定位试验，证明TCP2是一个核蛋白，其可能是与细胞核中的CRY1蛋白相互作用。本研究首次发现并证明了与CRY1直接相互作用的转录因子蛋白-TCP2，其相互作用在酵母细胞以及烟草细胞中表现出明显的蓝光特异性，而在拟南芥细胞中其蓝光特异性依赖特征消失，推测可能是由于酵母及烟草系统中无拟南芥蛋白，而实际相互作用中可能存在其他拟南芥蛋白参与CRY1与TCP2的相互作用。
　　通过生物信息学分析CRY1与TCP2的蛋白结构域，分段克隆CRY1和TCP2的多个结构域片段并通过酵母双杂交以及BiFC的方法，证明CRY1N端结构域(该结构域包含1-515的氨基酸序列，涵盖了光裂解酶结构域PHR)能与TCP2的特征结构域TCP（该区域包含TCP21-174氨基酸序列）相互作用。TCP结构域中的R结构域影响其与CRY1在酵母细胞中相互作用的蓝光依赖性。
　　遗传学研究结果表明，TCP2蓝光依赖性地抑制拟南芥下胚轴的伸长，这种蓝光特异性不仅表现在光波长的特异性上还表现为光强度的特异性依赖;其在红光和蓝光下能调控拟南芥幼苗的子叶形态，而在远红光下无此功能;其功能缺失突变体具有晚花的表型;我们的研究结果也进一步验证了TCP2蛋白调控叶片形态和大小方面的功能。
　　鉴于光作为环境影响因子在影响植物细胞内蛋白的表达以及CRY1在蓝光信号转导途径上的重要性，我们研究了TCP2蛋白在缺失CRY1与否的情况下对于不同光响应而做出的表达水平变化。通过免疫印迹试验检测Myc-TCP2/WT和Myc-TCP2/cry1转基因材料中TCP2的蛋白变化，结果证明TCP2是一个光响应的蛋白，其会在蓝光下大幅积累而在黑暗和远红光下降解，红光下也会有积累但积累的量和速率远不及蓝光下;同时，CRY1的缺失会影响到TCP2蛋白的稳定以及积累速度。蛋白酶抑制剂MG132的处理结果表明，TCP2蛋白是通过26S蛋白酶体泛素化途径降解。通过Luciferase assay测定翻译抑制剂CHX处理下不同背景（包括WT、CRY1突变体cry1、cry1cry2双突变体和ZTL3突变体ztl3-1）中LUC-TCP2对蓝光的响应，结果证明TCP2在蓝光下的积累是受到多个蓝光受体的影响，且mRNA的翻译量会影响到蛋白的积累，这也侧面地证明不同蓝光受体都会通过影响TCP2的mRNA的表达量影响TCP2蛋白的积累。
　　对于TCP2 mRNA光影响因子的研究结果表明，TCP2的mRNA表达量通过光特异性依赖的方式受到许多光受体的影响。TCP2作为一个核定位的转录因子蛋白正调控HY5、HYH、CAB和CHS的mRNA的表达。RBSS(Radom binding sites selection)结果表明TCP2的DNA结合位点为GGGGNCC。另外ChIP-qPCR结果表明TCP2蛋白能蓝光特异性结合HY5和HYH的启动子区域中的TCP2结合位点或相似性位点。以上结果表明TCP2作为转录因子作用于许多光受体的下游，其中就包括CRY1。
　　为了更好地研究CRY1与TCP2蛋白在植物内的相互作用，本研究设计了一套双基因载体pDTs（pDT1、pDT7和pDT7G），以期通过一次植物转化实现两个蛋白的同时表达。本研究构建多对基因至双基因载体并转入烟草或拟南芥中，通过定量、免疫印迹、荧光显微镜、免疫共沉淀、转基因表型分析以及共表达效率分析试验分析双基因载体的实用性，得到如下结果:(1)多对基因通过双基因表达载体在植物细胞内成功共表达;(2)pDT7G载体上cGR实现了其核质转移功能;(3)共表达双基因的生理生化功能未受影响;(4)双基因载体能实现双基因在植物细胞内的高效共表达。

目录

声明

摘要

英文缩写词

第1章 绪论

1．1 隐花色素的研究概况

1．1．1 拟南芥隐花色素CRY1简介

1．1．2 隐花色素CRY1的结构

1．1．3 隐花色素CRY1相互作用蛋白的研究

1．1．4 隐花色素CRY1的主要功能

1．1．5 隐花色素CRY1的信号传导机制

1．2 转录因子TCP的研究概况

1．2．1 转录因子TCP家族简介

1．2．2 TCP蛋白的亚细胞定位研究

1．2．3 miR319以TCP家族基因为靶标调控其表达和功能的机制

1．2．4 转录因子TCP家族生化功能研究简介

1．2．5 转录因子TCP参与的信号途径

1．3 本论文的工作设想

第2章 植物蓝光受体CRY1与TCP2蛋白的相互作用

2．1 实验材料与方法

2．1．1 质粒载体

2．1．2 材料

2．1．3 试剂

2．1．4 试验仪器

2．1．5 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 酵母双杂交筛库结果

2．2．2 TCP2是一个具有多聚化功能的核定位蛋白

2．2．2 转录因子TCP2与CRY1在酵母细胞中蓝光特异性相互作用

2．2．3 转录因子TCP2与CRY1在烟草叶片细胞中蓝光特异性相互作用

2．2．4 双基因载体的构建及其验证

2．2．5 转录因子TCP2与CRY1在拟南芥细胞中相互作用

2．3 小结

第3章 CRY1与TCP2蛋白的相互作用的结构域

3．1 材料与方法

3．1．1 载体

3．1．2 试验仪器

3．1．3 试验材料

3．1．4 方法

3．3 结果与分析

3．3．1 CRY1蛋白与TCP2各结构域的相互作用

3．3．2 TCP2蛋白与CRY1蛋白各结构域的相互作用

3．3 小结

第4章 TCP2蛋白对植物生长发育方面的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 植物材料

4．1．2 试验仪器

4．1．3 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 TCP2蛋白调节下胚轴的伸长

4．2．2 TCP2影响子叶和叶片的形态和大小

4．2．3 TCP2控制开花时间

4．3 小结

第5章 TCP2蛋白是一个光响应蛋白

5．1 材料与方法

5．1．2 试验试剂

5．1．3 试验材料

5．1．4 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 TCP2蛋白光特异性积累

5．2．2 TCP2蛋白表达水平对不同光的响应变化

5．2．3 TCP2蛋白表达受多个蓝光受体的调节

5．3 小结

第6章 TCP2蛋白参与蓝光信号传导的分子机制

6．1 材料与方法

6．1．1 试验材料

6．1．2 试验仪器

6．1．3 试验试剂

6．1．4 方法

6．2 结果与分析

6．2．1 TCP2蛋白正调控CRY1下游基因

6．2．2 TCP2蛋白DNA启动子特异性结合位点

6．2．3 ChIP-PCR研究分析TCP2对光相关基因DNA序列的绑定

6．3 小结

结论

参考文献

攻读学位期间所发表和完成的学术论文目录

附录

致谢