软骨组织工程PHBV支架表面修饰及其生物相容性研究

摘要

关节软骨是人体最容易受到损伤的组织之一，由于软骨组织内无血管，软骨层损伤的修复能力十分有限。组织工程通过将细胞-支架复合培养，构建软骨，以重建受损软骨的生理功能，因此，组织工程有望为临床修复关节软骨缺损提供一种新的治疗方法。支架材料是组织工程的基础之一，它不仅为活性细胞提供结构支撑，而且起模板作用，引导组织再生和控制组织结构。因此研发合适的支架材料成为软骨组织工程研究的重要课题。
　　聚（3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯）(PHBV)是原核微生物合成的天然高分子共聚物，具有良好的生物相容性、生物可降解性、热稳定性和力学性能，因此作为支架材料广泛应用于组织工程领域。然而，PHBV亲水性较差，表面缺少细胞可识别的反应位点，不利于细胞的贴附、生长和增殖。材料表面修饰是提高材料生物学性能的有效方法。本研究采用亲水性的天然生物大分子γ-聚谷氨酸(poly(γ-glutamic acid)，γ-PGA)和透明质酸(hyaluronic acid，HA)对PHBV材料表面进行改性修饰，从而提高PHBV材料的表面活性和生物相容性。
　　本研究首先采用静电纺丝技术制备出次微米级的PHBV纤维支架，然后利用1，6-己二胺胺解在PHBV纤维支架材料表面引入自由胺基，并以此为反应活性位点将γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和透明质酸(HA)固定接枝在PHBV材料表面，分别制备出γ-PGA接枝改性的PHBV纤维支架和HA接枝改性的PHBV纤维支架。扫描电镜观察可知静电纺丝法制备的PHBV纤维支架表面平滑程度高，纤维直径分布较均匀;FTIR检测结果表明，1，6-己二胺改性、γ-PGA和HA接枝改性PHBV纤维支架材料均成功实现;茚三酮法测定结果表明PHBV表面胺基密度随胺解时间增加而增大，在胺解约50分钟时达到最大值;经天然生物大分子γ-PGA和HA接枝改性后，PHBV纤维直径略微提高，但无显著差异。视频光学水接触角测量表明，接枝γ-PGA和HA后，PHBV材料表面水接触角明显下降，说明亲水性明显改善;热机械分析测试证明经γ-PGA接枝改性的PHBV纤维支架材料的最终拉伸强度和杨氏模量有了显著提高。
　　体外细胞培养结果表明，γ-PGA改性修饰的PHBV纤维支架可明显促进骨髓间充质干细胞贴附，HA接枝改性的PHBV纤维支架结构有利于软骨细胞贴附生长。Alamar Blue检测结果表明γ-PGA改性修饰的PHBV纤维支架显著促进干细胞的体外增殖;HA接枝改性的PHBV纤维支架可明显提高软骨细胞的增殖活性。综上所述，经天然生物活性大分子γ-PGA和HA表面改性修饰后，PHBV纤维支架的物理化学性质和生物相容性均有效提高，有望应用于软骨组织工程领域。

目录

声明

摘要

插图索引

附表索引

第1章 绪论

1．1 引言

1．2 软骨组织工程

1．2．1 软骨组织工程的定义

1．2．2 软骨组织工程原理和方法

1．3 软骨组织工程支架

1．3．1 软骨组织工程支架制备方法

1．3．2 软骨组织工程支架材料分类

1．3．3 软骨组织工程种子细胞及生长因子

1．4 软骨组织工程支架聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸酯)复合改性

1．4．1 软骨组织工程支架复合改性

1．4．2 聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸酯)复合改性的研究现状

1．4．3 聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸酯)(PHBV)表面修饰

1．5 课题的提出及主要研究内容

第2章 实验内容与方法

2．1 实验原料及设备

2．2 实验方法

2．2．1 静电纺丝法制备PHBV纤维支架

2．2．2 PHBV纤维支架表面引入自由胺基

2．2．3 γ-PGA改性PHBV纤维支架的制备

2．2．4 HA改性PHBV纤维支架的制备

2．3 材料物理性能测试与表征手段

2．3．1 材料形貌分析

2．3．2 傅里叶变换红外光谱检测

2．3．3 表面胺基密度的测定

2．3．4 力学强度分析

2．3．5 亲水性检测

2．4 材料生物学表征

2．4．1 细胞系选择

2．4．2 细胞培养相关试剂的配制

2．4．3 干细胞提取

2．4．4 软骨细胞复苏

2．4．5 细胞传代分瓶

2．4．6 改性PHBV纤维支架材料的预处理

2．4．7 细胞与PHBV纤维支架材料共培养

2．4．8 Alamar Blue方法检测细胞增殖活性

2．4．9 细胞固定与观察

第3章 γ-PGA改性PHBV纤维支架的制备及对软骨种子细胞增殖的影响

3．1 静电纺丝法制备PHBV纤维支架参数的探索

3．1．1 PHBV静电纺丝纤维支架的制备

3．1．2 聚合物浓度对纺丝纤维形貌的影响

3．1．3 电场电压对纺丝纤维形貌的影响

3．1．4 接收距离对纺丝纤维形貌的影响

3．1．5 溶液流速对纺丝纤维形貌的影响

3．1．6 小结

3．2 静电纺丝PHBV纤维支架表面引入自由胺基的条件探索

3．2．1 胺解PHBV纤维支架的制备

3．2．2 茚三酮法定量测定PHBV材料表面胺基密度

3．2．3 胺解浓度对材料表面胺基密度的影响

3．2．4 胺解时间对材料表面胺基密度的影响

3．2．5 胺解时间对材料表面亲水性的影响

3．3 γ-PGA改性PHBV纤维支架的制备与结构性能表征

3．3．1 胺解PHBV纤维支架表面固定γ-PGA生物活性分子

3．3．2 γ-PGA改性PHBV纤维支架的性能表征

3．4 γ-PGA改性PHBV纤维支架对软骨种子细胞增殖的影响

3．4．1 干细胞在γ-PGA改性PHBV纤维支架材料上生长形貌

3．4．2 干细胞在γ-PGA改性PHBV纤维支架材料上的增殖活性

3．4．3 软骨细胞在γ-PGA改性PHBV纤维支架材料上生长形貌

3．4．4 软骨细胞在γ-PGA改性PHBV纤维支架材料上的增殖活性

3．5 本章小结

第4章 HA改性PHBV纤维支架的制备及对软骨细胞增殖的影响

4．1 前言

4．2 HA改性PHBV纤维支架的制备与结构性能表征

4．2．1 胺解PHBV纤维支架表面固定HA生物活性大分子

4．2．2 SEM分析

4．2．3 FTIR分析

4．2．4 亲水性检测

4．3 软骨细胞在HA改性的PHBV纤维支架材料上的生长形貌

4．4 软骨细胞在HA改性PHBV纤维支架材料上的增殖活性

4．5 本章小结

结论

参考文献

致谢

附录A (攻读学位所期间发表的学术论文目录)