胍盐离子液体用于中药和蛋白质的分离分析及细胞机电性质研究

摘要

离子液体作为一种绿色溶剂，具有许多独特的物理化学性质，已获得广泛关注。离子液体双水相萃取技术是提取和纯化生物活性物质的一种新型分离方法。功能化离子液体双水相体系能有效地将离子液体与双水相萃取技术的优点相结合，具有无毒、安全、简便、快速的特点，已被广泛应用于生物转化，分离纯化蛋白质、核酸和病毒等多个研究领域。功能化离子液体磁性固相萃取技术是在磁性固相萃取剂的表面修饰上功能化离子液体，从而形成具有某种特定功能或者应用的一种新型固相萃取技术。
　　胍盐离子液体是离子液体家族中的新成员，它合成简单、热稳定性和化学稳定性高、生物活性强、具有很好的可设计性。
　　本研究前3个工作设计合成了胍盐离子液体，结合微波萃取技术用于中药前胡有效成分的分离分析;将胍盐离子液体进行功能化，结合双水相萃取技术和磁性固相萃取技术，建立了萃取分离蛋白质的方法。
　　随后由于赴加州大学洛杉矶分校进行博士联合培养（2014年9月-2016年7月），本研究后3个工作转化为心肌细胞电生理性质的研究和癌细胞的机械性质研究，从电生理的角度考察了心肌细胞的成熟过程，并探究了葡萄糖在心肌细胞成熟过程中所扮演的角色，为细胞电生理活动的研究提供了一种有效方法。以膀胱癌细胞为样本，提出了一种从单细胞层面检测癌细胞机械性质的方法。论文主要内容如下:
　　(1)胍盐离子液体微波辅助萃取中药前胡中的白花前胡甲素
　　提出了一种胍盐离子液体微波辅助萃取法，对中药前胡的活性成分——白花前胡甲素进行萃取。萃取后，反相高效液相色谱结合紫外检测器用于白花前胡甲素含量的测定。通过单因素实验和三水平四因素正交实验优化了萃取工艺参数，白花前胡甲素萃取量最高值达到11.92±0.10 mg/g。将所拟萃取方法与胍盐离子液体热回流萃取法、胍盐离子液体冷浸萃取法和胍盐离子液体超声辅助萃取法进行比较，发现胍盐离子液体微波辅助萃取法萃取率最高，耗时最短。白花前胡甲素在0.005-0.200 mg/mL范围内峰面积与浓度线性关系良好，最低检出限为2.07μg/mL，样品的回收率在99.23-100.07％之间。方法学考察结果表明:本研究建立的分析方法精密度、重现性和稳定性均良好，其中精密度实验与重现性实验所得相对标准偏差(RSD)分别为0.34％和0.52％，稳定性实验中标准溶液的白花前胡甲素RSD为0.67％，萃取溶剂中的白花前胡甲素RSD为1.0％。采用动力学曲线、场发射扫描电子显微镜(SEM)和傅立叶变换红外光谱技术(FTIR)对前胡萃取前后残渣的表面微观结构和成分进行了研究，初步探讨了胍盐离子液体微波辅助萃取法的萃取机理。最后将所拟方法用于前胡实际药材分析，结果表明:因产地不同，药材中白花前胡甲素的含量差异显著。
　　(2)功能化胍盐离子液体双水相萃取蛋白质
　　合成了一系列新型的阳离子功能化六烷基胍盐离子液体和阴离子功能化四烷基胍盐离子液体，将这些功能化离子液体与磷酸盐溶液形成双水相体系用于蛋白质的萃取分离分析。采用紫外光谱分析法在278 nm处对代表性蛋白质BSA进行定性及定量分析检测。研究采用单因素实验优化了萃取参数，其萃取工艺参数的最佳组合为:离子液体用量4.0 mmol，盐溶液浓度0.6 g/mL，温度25℃，蛋白质加入量在12-24 mg区间内，得到蛋白质的最高萃取率为97.05％。在同等条件下，比较了功能化胍盐离子液体双水相体系与普通离子液体双水相体系的萃取能力，发现功能化胍盐离子液体双水相体系成相能力更强，萃取率更高。方法学考察结果表明:本研究建立的分析方法精密度、重现性和稳定性均良好，其RSD分别为1.1％、1.6％和1.8％。采用动态光散射法(DLS)、电导率测定法和透射电镜技术(TEM)对离子液体双水相体系萃取蛋白质的机理进行了研究，发现蛋白质粒子和离子液体粒子在萃取过程中发生了簇集。并通过紫外光谱(UV)、红外光谱(FTIR)和园二色谱(CD)对蛋白质萃取前后结构变化进行了研究，结果表明:萃取后，蛋白质分子的二级结构并没有被破坏。
　　(3)功能化胍盐离子液体修饰的磁性颗粒固相萃取蛋白质
　　制备了磁性壳聚糖-氧化石墨烯磁性颗粒(MCGO)，将它分别修饰上不同的新型功能化胍盐离子液体(FGILs)，以此作为固相萃取剂(MCGO-FGILs)，结合磁性固相萃取技术，用于蛋白质的萃取分离分析。通过红外光谱(FTIR)、振动样品磁强计(VSM)、扫描电子显微镜(SEM)、X射线衍射(XRD)对所合成的磁性固相萃取剂进行了表征。采用紫外光谱分析法在278 nm处对蛋白质进行定性及定量分析检测。经过一系列单因素实验获得最优萃取条件为:蛋白质浓度2.5mg/mL，MCGO-FGILs加入量12 mg，pH值5.0，温度30℃，萃取时间30分钟。得到的萃取容量分别为:18.9833 mg/g(BSA)，20.6725 mg/g(OVA)，35.2640 mg/g(Try)，38.4006 mg/g(Lys)。将MCGO-FGILs与磁性壳聚糖(MC)、氧化石墨烯(GO)、磁性壳聚糖-氧化石墨烯磁性颗粒(MCGO)进行了比较，发现MCGO-FGILs的萃取量最高，达到48.8 mg/g。用1.0％ NaOH溶液做洗脱液，考察了MCGO-FGILs的洗脱和重复利用能力，发现使用三次之后，MCGO-FGILs的萃取能力仍有94.0％。方法学考察结果表明仪器精确性、方法重现性和稳定性良好，其相对标准偏差(RSD)分别为1.3％、1.7％和1.0％。
　　(4)小鼠胚胎干细胞分化的心肌细胞成熟过程中电生理特性研究
　　设计了一个由小鼠胚胎干细胞分化的心肌细胞二维融合层构成的细胞外场电位检测体系，利用微电极阵列系统从电生理角度对细胞的成熟情况进行了实时监测。所得信号类似心电图，通过对细胞心跳间期、场电位振幅、场电位持续时间、传导速度、去极化过程进行分析，发现在小鼠心肌细胞的成熟过程中，细胞的场电位振幅和传导速度随细胞逐渐成熟得到了增长，而心跳间期和场电位持续时间始终保持稳定，其中心跳间期始终维持在1.5 s左右，场电位持续时间维持在0.2-0.4 s之间。利用Matlab软件从时间和空间的角度对细胞电信号进行分析，找到了心肌细胞的起博点位置并得到了电信号的传播趋势，对细胞的成熟过程进行了表征，为下一章的工作奠定了基础。
　　(5)葡萄糖缺乏对人体胚胎干细胞分化的心肌细胞成熟过程的影响研究
　　设计了一个由人体胚胎干细胞分化的心肌细胞二维融合层构成的细胞外场电位检测体系，利用微电极阵列系统从电生理角度对细胞的成熟情况进行实时监测。通过对比实验研究了葡萄糖对心肌细胞成熟过程的影响。利用Matlab软件对细胞的心跳间期、场电位振幅、场电位持续时间、传导速度及去极化过程进行了分析，发现人体胚胎干细胞分化的心肌细胞在葡萄糖缺乏条件下场电位振幅、电信号传导速度和去极化过程分别从420.6μV、31.9 mm/s和2.8μV/ms增长为609.8μV、89.5 mm/s和17.2μV/ms，表明心肌细胞在葡萄糖缺乏条件下成熟度得到了很大提高，说明葡萄糖缺乏能够促进心肌细胞的成熟。
　　(6)膀胱癌细胞的机械性质表征研究
　　研究得出了一种基于单细胞层面的膀胱癌细胞机械性质检测法，利用原子力显微技术研究了膀胱癌细胞在4-氨基联苯处理下的硬度变化，发现细胞癌变后杨氏模量均有降低。通过对原子力显微镜的针尖进行精确控制，确保针尖始终按压于细胞核的区域。利用Matlab软件对所得的大量数据进行了处理分析，对原子力显微镜获得的力学曲线进行分段拟合计算杨氏模量，探讨了不同按压程度下的细胞硬度，发现当按压深度从100 nm上升至1000 nm后，细胞的杨氏模量从100 kPa迅速降低至10 kPa以下。利用Origin软件、Matlab软件构建了直观二维阵列图，发现图中按压深度峰的位置转移能很好地描述细胞局部硬度的变化。该技术不仅为研究细胞的机械表型生物标记奠定了基础，也为进一步从分子层面解密细胞机械性质提供了可能。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 胍盐离子液体

1．1．1 离子液体

1．1．2 胍盐离子液体

1．1．3 胍盐离子液体的合成

1．1．4 胍盐离子液体的性质

1．1．5 胍盐离子液体的应用

1．1．6 问题与展望

1．2 离子液体的功能化及其在萃取分离中的应用

1．2．1 离子液体的功能化

1．2．2 功能化离子液体的种类

1．2．3 功能化离子液体的特性和优势

1．2．4 功能化离子液体在萃取分离中的应用

1．2．5 问题与展望

1．3 中药的萃取分离

1．3．1 中药简介

1．3．2 中药萃取分离方法

1．3．3 问题与展望

1．4 前胡植物资源及其研究现状

1．4．1 前胡本草考证

1．4．2 前胡药用价值

1．4．3 前胡化学成分

1．4．4 前胡研究进展

1．4．5 问题与展望

1．5 蛋白质的萃取分离

1．5．1 蛋白质简介

1．5．2 蛋白质萃取分离方法

1．5．3 问题与展望

1．6 细胞的电生理特性检测

1．6．1 生物电与细胞的电生理特性

1．6．2 细胞电生理特性检测技术

1．7 细胞的机械特性检测

1．7．1 细胞的机械特性

1．7．2 细胞机械特性检测技术

1．7．3 问题与展望

1．8 论文选题思路及研究内容

第2章 胍盐离子液体微波辅助萃取中药前胡中的白花前胡甲素

2．1 前言

2．2 实验方法

2．2．1 仪器

2．2．2 材料与试剂

2．2．3 离子液体的合成与表征

2．2．4 胍盐离子液体-微波辅助萃取

2．2．5 不同萃取方法的比较

2．2．6 高效液相色谱分析

2．2．7 萃取机理研究

2．3 结果与讨论

2．3．1 萃取溶剂的选择

2．3．2 胍盐离子液体-微波辅助萃取实验条件的优化

2．3．3 不同萃取方法的比较

2．3．4 定性与定量分析

2．3．5 方法学考察

2．3．6 加标回收率实验

2．3．7 实际样品分析

2．3．8 萃取机理研究

2．4 本章小结

第3章 功能化胍盐离子液体双水相萃取蛋白质

3．1 前言

3．2 实验方法

3．2．1 仪器

3．2．2 材料与试剂

3．2．3 离子液体的合成

3．2．4 离子液体的表征

3．2．5 双水相体系相图的绘制

3．2．6 离子液体双水相体系萃取蛋白质

3．2．7 萃取前后蛋白质结构研究

3．2．8 萃取机理研究

3．3 结果与讨论

3．3．1 双水相体系相图的绘制

3．3．2 双水相体系离子液体萃取能力的比较

3．3．3 双水相体系萃取不同蛋白质比较

3．3．4 双水相体系萃取条件的优化

3．3．5 方法学考察

3．3．6 萃取前后蛋白质结构研究

3．3．7 萃取机理研究

3．4 本章小结

第4章 功能化胍盐离子液体修饰的磁性颗粒固相萃取蛋白质

4．1 前言

4．2 实验方法

4．2．1 仪器

4．2．2 材料与试剂

4．2．3 磁性壳聚糖-氧化石墨烯的制备

4．2．4 磁性壳聚糖-氧化石墨烯-离子液体的制备

4．2．5 磁性颗粒及固相萃取剂的表征

4．2．6 磁性颗粒的等电点测定实验

4．2．7 磁性固相萃取蛋白质实验

4．2．8 洗脱与重复利用实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 磁性颗粒及固相萃取剂的表征

4．3．2 磁性颗粒的等电点测定

4．3．3 不同离子液体萃取能力的比较

4．3．4 磁性固相萃取不同蛋白质比较

4．3．5 磁性固相萃取条件的优化

4．3．6 萃取容量比较

4．3．7 洗脱和重复利用实验

4．3．8 方法学考察

4．4 本章小结

第5章 小鼠胚胎干细胞分化的心肌细胞成熟过程中的电生理特性研究

5．1 前言

5．2 实验方法

5．2．1 仪器

5．2．2 材料与试剂

5．2．3 细胞的二维培养

5．2．4 微电极阵列检测

5．2．5 场电位峰的检测

5．2．6 心跳间期测定

5．2．7 场电位振幅测定

5．2．8 场电位持续时间测定

5．2．9 场电位传播趋势研究

5．2．10 传导速度测定

5．2．11 去极化过程研究

5．3 结果与讨论

5．3．1 场电位峰的检测

5．3．2 心跳间期

5．3．3 场电位振幅

5．3．4 场电位持续时间

5．3．5 场电位传播趋势

5．3．6 传导速度

5．3．7 去极化过程

5．4 本章小结

第6章 葡萄糖缺乏对人体胚胎干细胞分化的心肌细胞成熟过程的影响研究

6．1 前言

6．2 实验方法

6．2．1 仪器

6．2．2 材料与试剂

6．2．3 细胞的二维培养

6．2．4 葡萄糖缺乏对细胞影响的实验设计

6．2．5 微电极阵列检测

6．2．6 场电位峰的检测

6．2．7 心跳间期测定

6．2．8 场电位振幅测定

6．2．9 场电位持续时间测定

6．2．10 传导速度测定

6．2．11 去极化过程研究

6．3 结果与讨论

6．3．1 场电位峰的检测

6．3．2 心跳间期

6．3．3 场电位振幅

6．3．4 场电位持续时间

6．3．5 传导速度

6．3．6 去极化过程

6．3．7 结果验证

6．4 本章小结

第7章 膀胱癌细胞的机械性质表征研究

7．1 前言

7．2 实验方法

7．2．1 仪器

7．2．2 材料与试剂

7．2．3 细胞培养与处理

7．2．4 细胞硬度的测定

7．2．5 力学曲线的拟合

7．2．6 接触点的确定

7．2．7 不同凹陷深度下细胞硬度的测定

7．2．8 统计分析

7．3 结果与讨论

7．3．1 按压位置的确定

7．3．2 4-ABP对膀胱癌细胞硬度的影响

7．3．3 不同凹陷深度下的细胞硬度

7．3．4 细胞硬度与凹陷深度的二维关系

7．3．5 不同4-ABP浓度的影响

7．4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢