用于内源性物质分析的双光子荧光探针的构建与成像研究

摘要

小分子荧光探针具有灵敏度高、选择性好、成本低廉、响应迅速等优点，是对生物体系中目标分子进行高时空分辨成像研究的有力工具。通过结构设计，可以调控小分子荧光探针对目标分子的结合常数、动力学、激发/发射波长，并实现细胞器的精准定位。因此，科研工作者们设计并合成了针对各种目标物、靶向各种细胞器的荧光探针。相较于传统的单光子荧光探针，双光子荧光探针具有更深的组织穿透深度、更高的空间分辨率以及更小的光损伤和光漂白效果，在生物样品的实际应用中具有更广阔的前景。因此，开发针对不同目标物的双光子荧光探针，实现对生物体系内目标分子高灵敏度、高特异性地检测与成像，对临床诊断、生物医学研究等领域有着重要的意义，并有望推动对生命过程的研究。
　　基于以上原因，在广泛查阅文献的基础上，本文设计并合成了一系列新型的双光子荧光探针，并将其成功应用于生物体系内源性物质的分析与检测，主要内容如下：
　　（1）在第2章中，我们设计并合成了对超氧阴离子自由基有特异性识别的双光子荧光探针 L1。含有电子供体-π-电子受体结构的萘衍生物具有较高的荧光量子产率、较大的双光子吸收截面和较好的光稳定性，是构建双光子荧光探针的母体结构。在探针 L1中，萘衍生物的羟基分子被三氟甲基磺酸基取代，探针分子的电子供体-π-电子受体结构被破坏，荧光大大降低。当有目标物超氧阴离子自由基存在时，超氧阴离子自由基对取代基进行亲核攻击，致使取代基离去，恢复了双光子荧光染料原有的电子供体-π-电子受体结构，其荧光增强。经过对 L1的分析检测性能考察，我们发现 LI具有较高的灵敏度和较宽的线性响应范围，其检测限为1 nM。且生物体内的其他活性氧物质、活性氮物质、常见的细胞内还原物质等对探针的影响很小，说明该探针具有较好的选择性。该探针可以应用于活细胞和组织，实现活细胞内源性超氧阴离子自由基的成像分析以及超氧阴离子自由基的组织成像。
　　（2）在第3章中，我们进一步探究并开发了发射波长在近红外区域的双光子荧光染料 TP-NIR-OH和双光子荧光探针 TP-NIR-HS。受具有电子受体-π-电子供体-π-电子受体(A-π-D-π-D-)结构的长吸收波长的有机分子启发，我们设计并合成了一种新的双光子荧光染料 TP-NIR-OH，其激发和发射波长均落于近红外光区，具有相对于一般双光子荧光基团更大的活性吸收截面(>180 GM)、更长的斯托克斯位移(>70 nm)、更深的组织穿透深度(90-390μm)，可以实现高时空分辨的活体成像，为构建近红外发射的双光子荧光探针提供了良好的平台。基于上述设计并合成的双光子荧光染料 TP-NIR-OH，我们将对硫化氢具有特异性响应的2，4-二硝基苯基与 TP-NIR-OH以醚键的形式结合在一起，建立了一个具有近红外发射的双光子荧光探针模型 TP-NIR-HS。该探针 TP-NIR-HS对硫化氢表现出了较高的灵敏度和选择性，并可应用于生物体内硫化氢的检测与成像，成功实现了细胞内源性硫化氢的半定量检测以及高分辨成像，也实现了裸鼠体内硫化氢的成像。
　　（3）在第4章中，我们结合羟基氧化钴(CoOOH)纳米片和双光子荧光探针(TPdye)的优势，设计并合成了一种新型的 CoOOH/TPdye双光子荧光纳米探针，并初步应用于成像细胞内抗坏血酸水平的变化。受益于 CoOOH纳米片独特的理化性质与光学性质，我们首先将双光子荧光染料 TPdye物理吸附于 CoOOH纳米片上，由于 CoOOH纳米片的吸收光谱与 TPdye的荧光发射光谱有较好的重叠， CoOOH纳米片与 TPdye之间发生有效的能量转移，导致其双光子荧光被高效猝灭。当存在抗坏血酸时，抗坏血酸与 CoOOH纳米片发生特异性的氧化还原反应，使 CoOOH纳米片结构被破坏，导致 TPdye从其表面脱附，能量转移过程被阻止， TPdye的荧光得到显著恢复。在缓冲体系中的实验证明了 CoOOH/TPdye双光子荧光纳米探针具有较高的灵敏度和选择性。在进一步的生物体系应用中，该探针表现了较好的生物相容性和膜穿透能力，成功实现了对细胞内抗坏血酸的半定量检测与荧光成像。
　　（4）大部分荧光分子由于能量的损失等原因，在处于聚集态时会出现荧光猝灭的现象，即聚集荧光猝灭效应(aggregation-caused quenching, ACQ)。ACQ现象的存在严重制约了荧光生色团的应用。与 ACQ现象相反，有的发光材料在稀溶液中几乎不发光，反而在聚集态下荧光显著增强，这种现象被命名为聚集态诱导发光效应(aggregation-induced emission，AIE)。典型的 AIE生色团包括四苯乙烯、六苯基噻咯及他们的衍生物。在第5章中，我们首次将具有 AIE效应的四苯乙烯衍生物分子与被劈成四段的富 G寡核苷酸链通过化学键结合在一起，构建了新型的“turn-on”型荧光探针用于细胞内钾离子的原位检测与成像。该探针表现出了相较于其他基于 G四股螺旋结构的钾离子探针更高的灵敏度(检测限为5μM)，实现了细胞内钾离子的原位检测与成像，为生物体内钾离子的分析检测和病理学研究提供了良好的工具。

目录

声明

第1章 绪 论

1.1 引言

1.2 双光子荧光简介

1.3双光子荧光探针的研究进展

1.4 本研究论文的构想

第2章 基于萘衍生物的高灵敏度超氧阴离子自由基双光子荧光探针的研究

2.1 前言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第3章 具有近红外发射的双光子荧光探针的构建与应用

3.1 前言

3.2 实验部分

3.3 双光子荧光基团TP-NIR-OH的考察结果与讨论

3.4 双光子荧光探针TP-NIR-HS的考察结果与讨论

3.5 小结

第4章 用于活细胞中抗坏血酸成像的双光子荧光纳米探针的构建

4.1 前言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 小结

第5章 基于四苯乙烯衍生物修饰的功能核酸荧光探针用于细胞内钾离子的检测与成像

5.1 前言

5.2 实验部分

5.3 结果与讨论

5.4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢