基于环糊精聚合物增强荧光的DNA修复酶活性检测研究

摘要

DNA修复酶是一类参与DNA损伤修复过程的蛋白酶，它可以保护DNA免受内源性或外源性因素造成的损伤，维持遗传物质的稳定性。DNA修复酶活性异常不利于DNA损伤的修复，使得细胞停止生长、凋亡或转变成癌细胞，导致生物个体不可避免地出现老化、死亡、肿瘤形成等症状。因此，DNA修复酶活性的检测，对于维持基因组完整、癌症诊断及治疗有着重要的意义。
　　环糊精聚合物不仅稳定性强、水溶性好，而且还有包络识别能力及多价结合效应等优点。前期研究发现?-环糊精聚合物能显著增强芘的荧光，利用该现象可发展高灵敏的荧光分析检测方法。基于此，本文利用核酸探针技术和?-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用，建立了脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶（APE1）和尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）的荧光检测方法，具体内容如下：
　　1．基于?-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用，并结合核酸分子探针技术发展了一种灵敏检测APE1活性的方法。本方法中，功能化双链DNA探针AP-S1S1和?-环糊精聚合物分别为信号产生单元和信号增强单元。当没有APE1存在时，由于双链的空间位阻较大，芘难以嵌入?-环糊精聚合物的空腔，荧光信号较弱，荧光各向异性较低；当APE1存在时，可以识别并切割双链探针上的AP位点，形成标芘的单链核酸片段，空间位阻较小，芘极易嵌入?-环糊精聚合物空腔，荧光信号显著增强，荧光各向异性显著增加。这一检测方法探针设计简单，操作简便，能实现APE1活性的灵敏检测，其检测限为0.05 U/mL，并且具有较好的选择性。该方法还实现了细胞裂解液中APE1活性的检测，有望用于发展一种通用型的检测平台。
　　2．在前一章工作的基础上，结合APE1能识别切割AP位点的特性，发展了一种灵敏检测UDG活性的荧光方法。设计了互补探针P1和P2，其中P1的两端均被延长，P2设计有一个尿嘧啶且5'端标芘。本方法以芘为信号单元，?-环糊精聚合物为信号增强单元。当没有UDG存在时，两条 DNA探针能够形成稳定的双链结构U-P1P2，由于空间位阻较大，芘难以嵌入?-环糊精聚合物的空腔，荧光信号较弱，荧光各向异性较低；当 UDG存在时，可以识别并切割双链探针上的尿嘧啶，在DNA链上形成一个缺口，也就是AP位点，再用 APE1辅助切割，标芘的核酸片段从双链上掉落下来，芘的空间位阻变小，极易嵌入?-环糊精聚合物空腔，荧光信号显著增强，荧光各向异性显著增加。本方法具有良好的灵敏度和选择性，由于?-环糊精聚合物显著增强芘的荧光，检测限低至0.01 U/mL。同时，该方法还实现了细胞裂解液中UDG活性的检测。
　　3．在前两章工作中发现均相溶液中的检测方法都会面临着背景过高的问题，从而影响检测方法的灵敏度。本工作结合环糊精聚合物对芘的荧光增强作用和磁珠的富集和分离，构建了一种低背景且高灵敏的荧光方法用于 APE1活性检测。设计了互补探针 P1和 P2，其中 P1的3'端延长10个碱基且5'端修饰有生物素， P2设计有一个 AP位点且5'端标芘。当没有 APE1存在时，两条探针能够形成稳定的双链结构并富集在修饰有链霉亲和素的磁珠上，此时上清液由于没有芘分子，荧光强度和荧光各向异性均极低；当有目标物 APE1存在时，APE1识别并切割AP位点，标芘的核酸片段释放到上清液中，芘分子可与溶液中的?-环糊精聚合物发生主客体作用，荧光信号显著增强，荧光各向异性也显著增加。本方法降低了背景信号，灵敏度和选择性均较好，检测限为0.01 U/mL。同时，该方法还实现了细胞裂解液中APE1活性的检测。

目录

本文所用英文缩略词表

第1章 绪 论

1.1 DNA修复酶简介

1.2 DNA修复酶的检测

1.3 本文拟开展的工作

第2章 基于β-环糊精聚合物对芘的荧光增强作用的脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶（APE1）活性检测方法研究

2.1 前言

2.2 实验部分

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第3章 基于β-环糊精聚合物与芘的超分子自组装用于尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）活性检测方法研究

3.1 前言

3.2 实验部分

3.3 结果与讨论

3.4 小结

第4章 基于环糊精聚合物对芘的荧光增强作用和磁珠分离的脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶（APE1）活性检测方法研究

4.1 前言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 小结

结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录

致谢