水杨酸和水杨酸甲酯对拟南芥花粉管生长调控的分子机制研究

摘要

水杨酸是一类非常重要的植物激素，不仅参与了植物的抗病抗胁迫过程，同时也参与了植物的生长调控过程。目前虽然对水杨酸参与抗病的过程有一定的了解，但是在植物生长调控方面的研究甚少，其分子机理也不清楚。快速的顶端生长作为细胞极性生长的一种典型模式，在顶端生长的模式研究材料拟南芥花粉管中，已经发现了一些可以调控其生长的小分子植物激素，但这些易扩散的小分子物质是如何调控顶端的极性生长的目前仍不清楚。本论文以拟南芥为材料，探究了水杨酸及其衍生物水杨酸甲酯对其花粉管极性顶端生长的影响及作用机理。
　　水杨酸(SA)和水杨酸甲酯(MeSA)在植物体内可相互转化，二者主要参与了植物的抗病调控。在本研究中，我们首次发现了水杨酸和水杨酸甲酯对体外生长的花粉管具有拮抗的调控作用，即水杨酸抑制花粉管的生长，而水杨酸甲酯却显著的提高了花粉管的长度。通过对目前已知的 SA受体突变体 npr1、npr3、npr4和 npr3/npr4的花粉管体外生长的表型分析，发现 SA和 MeSA对花粉管的生长调控是不依赖于这三个已知的受体蛋白，这暗示着在花粉管中可能存在其他的 SA和 MeSA受体蛋白。为了进一步验证 SA和 MeSA对花粉管的生长影响，我们构建了水杨酸水解酶 NahG稳定过表达转基因植株，结果发现其花粉管长度明显较野生型长，且使得花粉管对 SA的抑制作用不敏感。这不仅证明了内源性水杨酸对花粉管的生长具有抑制作用，同时也进一步验证了水杨酸对花粉管生长的抑制作用。
　　为了探究 SA/MeSA在花粉管生长调控方面的分子机理，我们对几个重要的生理途径进行了研究分析，如在内吞和外排过程中发现水杨酸能抑制花粉管的内吞，而水杨酸甲酯却促进花粉管的内吞。通过细胞壁的免疫组化实验表明外源的水杨酸处理能使位于花粉管顶端的甲基化果胶减少，而位于柄区的去甲基化果胶明显增加，而外源 MeSA处理后出现相反的表型。通过 ROP1的 marker蛋白 CRIB4-GFP发现 SA增强花粉管顶端 ROP1的活性，反之，MeSA减弱其信号。REN1是活性 ROP1的负调控因子，通过外排的途径转运到花粉管顶端的细胞质中。为了进一步验证之前的结论，我们利用 REN1 marker转基因植株Lat52:GFP-REN1/ren1-1，对体外生长的花粉管分别做了 SA和 MeSA处理，结果表明 REN1 marker蛋白的荧光强度变化与 CRIB4-GFP的信号变化正好相反，这进一步确定水杨酸和水杨酸甲酯影响了花粉管顶端的 ROP1。以 ROP1表达量适中的过表达转基因植株 GFP-ROP1以及 REN1部分功能缺失突变体 ren1-3为材料，通过 SA和 MeSA的处理后发现 SA加强了其表型，而水杨酸甲酯减弱了其表型,这再次验证了 SA和 MeSA对 ROP1的影响。然而SA和 MeSA对外排途径，钙离子以及 actin的变化无显著性的影响。
　　水杨酸甲酯化酶与甲基转移酶可以催化 MeSA与 SA相互转换，水杨酸甲酯酶MES6与甲基转移酶BSMT1在花粉管中均有表达且MES6位于花粉管顶端的细胞膜上或靠近细胞膜的位置，与 ICR1/RIP1的亚细胞定位相似。BSMT1位于花粉管顶端的细胞质中，其形态分布与外排分泌小泡的形状相似。MES6和BSMT1的亚细胞位置暗示了 SA和 MeSA可能通过在花粉管顶端的相互转换来维持 SA在顶端位置的分布从而调控花粉管的顶端生长。通过正向遗传学研究方法，发现 mes6-1突变体的花粉管较野生型长且相对于野生型对 SA不敏感，而对 MeSA超敏感。这从遗传学上证明了 SA抑制花粉管的生长而 MeSA促进花粉管的生长。突变体 mes6-1背景下，CRIB-GFP的荧光强度下降，但震荡频率增加了，在细胞膜上过度积累的 GFP-ROP1信号下降且被限制在了花粉管的顶端位置。通过对 GFP-ROP1/mes6-1和 ren1-3/mes6-1的表型分析，发现突变体中，GFP-ROP1和 ren1-3的表型受到抑制，以上这些数据充分说明了在突变体 mes6-1中，ROP1的活性下降了，该结果与外源性 SA处理野生型花粉管的结论相一致。
　　本论文首次发现了水杨酸和水杨酸甲酯对拟南芥花粉管生长具有拮抗调节作用，且对其调控机制进行了较为深入的研究。SA/MeSA通过 CME途径和对ROP1活性的影响来调控花粉管的生长，且不依赖于已知的 SA受体蛋白NPR3/NPR4。在本论文中我们还发现 MES6和 BSMT1位于花粉管的顶端，且ROP1在突变体 mes6-1中的活性下降与体外 MeSA处理的结果一致，暗示着 SA和 MeSA这两个高度易分散的化学分子在花粉管的顶端相互转换，且调控着花粉管的顶端极性生长。

目录

声明

英文缩写词

第1章 绪 论

1.1水杨酸的研究概况

1.2 花粉管的极性生长

1.3本论文的工作设想

第2章 水杨酸和水杨酸甲酯对拟南芥花粉管生长的影响

2.1 材料与方法

2.2 结果与讨论

第3章 SA/MeSA对拟南芥花粉管内吞途径的影响

3.1 材料和方法：

3.2 结果与讨论

第4章 SA/MeSA对花粉管顶端ROP1 活性的影响

4.1 材料和方法

4.2 结果与分析

第5章 SA/MeSA对花粉管细胞壁果胶分布,calcium 和actin 的影响

5.1材料和方法

5.2 结果与讨论

第6章 MES6对ROP1活性的影响

6.1材料和方法

6.2结果与讨论

讨论与结论

参考文献

附录A 攻读学位期间所发表和完成的学术论文目录

附录B

附表1. 本研究中所用到的引物

致谢