转录因子FOXM1参与乳腺肿瘤干细胞调控的机制研究

摘要

乳腺癌是发生在乳腺上皮细胞的恶性肿瘤。乳腺癌异质性是恶性乳腺肿瘤的特征之一。在乳腺癌发生发展过程中，细胞经过多次分裂增殖，出现了增殖速度，转移能力，对药物的敏感性，血管生存能力和预后等性质不同的细胞亚群。乳腺肿瘤干细胞由一部分具有干性特征的肿瘤细胞亚群组成，具有与正常干细胞一样的自我更新能力和多向分化潜能，并能产生异质性乳腺肿瘤。因此研究乳腺肿瘤干细胞的发生发展分子机制显得尤为重要。转录因子 FOXM1是由 FOXM1基因编码产生的能识别RYA A AYA特定核苷酸序列，在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用。在肿瘤细胞中，转录因子FOXM1主要参与细胞周期G1/S期和G2/M期的转变和 M期的进程，调控细胞周期和 DNA损伤修复，促进血管生成和细胞迁移等生理过程。
　　本文研究的主要目的是探究转录因子 FOXM1是否参与了乳腺肿瘤干细胞发生、发展的调控，及其在这过程中可能的作用机制。
　　为探究转录因子 FOXM1是否参与乳腺肿瘤干细胞的发生，我们运用流式分析发现乳腺癌 MDA-MB-436细胞中 ALDH1+细胞亚群含量明显多于 MCF-7细胞中ALDH1+细胞亚群含量，并且FOXM1在乳腺癌MDA-MB-436细胞中的表达量明显高于 MCF-7细胞。同时通过FOXM1在MDA-MB-436细胞与MCF-7细胞的表达量分别对比 MDA-MB-436细胞与 MCF-7细胞的微球体形成能力和 FOXM1在 ALDH1+细胞亚群与 ALDH1-细胞亚群中表达量的差异，建立了转录因子FOXM1的表达水平与乳腺肿瘤细胞干性水平的相关性。除此之外，通过考察转录因子FOXM1表达水平在乳腺癌MDA-MB-436 ALDH1+细胞亚群，ALDH1-细胞亚群和 MDA-MB-436亲本细胞中表达量的差异和 MDA-MB-436细胞微球体培养样本与 MDA-MB-436正常培养中表达量的差异，发现FOXM1在乳腺癌肿瘤干细胞亚群中的表达上调。与此同时，构建表达 hFOXM1和 hFOXM1shRNA的慢病毒表达体系，并分别感染乳腺癌 MCF-7细胞和 MDA-MB-436细胞，发现高表达FOXM1可以促进乳腺癌MCF-7细胞干性的增强，而降低FOXM1表达水平可使MDA-MB-436细胞干性降低。
　　为探究转录因子 FOXM1参与乳腺肿瘤干细胞调控机制，我们基于 FOXM1启动子序列构建了Lv-PFOXM1/EGFP慢病毒体系示踪细胞内 FOXM1的表达，将此慢病毒分别感染乳腺癌 MCF-7和 MDA-MB-436细胞，并采用流式分选技术成功地在 FOXM1表达量高的乳腺癌 MDA-MB-436细胞中分离出了乳腺癌 MDA-MB-436-FOXM1Low细胞亚群和MDA-MB-436-FOXM1High细胞亚群，进一步实验发现乳腺癌 MDA-MB-436-FOXM1Low细胞亚群干性能力明显低于 MDA-MB-436-FOXM1High细胞亚群。通过转录组测序比较乳腺癌MDA-MB-436-FOXM1Low细胞亚群和MDA-MB-436-FOXM1High细胞亚群在转录组表达水平之间的差异，发现乙醛脱氢酶 ALDH1A2在MDA-MB-436-FOXM1High细胞亚群中高表达，分子和细胞生物学水平实验进一步研究发现转录因子FOXM1可直接与ALDH1A2启动子-555 to-549，-239 to-233两个位点结合参与ALDH1A2基因的表达调控。运用Protein Atlas数据库，TCGA数据库和Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现FOXM1在临床乳腺癌样本中高表达，并且 FOXM1表达与临床预后存在负相关性，发现临床乳腺癌病人FOXM1高表达促进乳腺癌的发生发展。
　　本研究发现转录因子 FOXM1对乳腺肿瘤干细胞特性的形成具有促进作用，抑制FOXM1的表达乳腺肿瘤干细胞特性表现降低。乳腺癌细胞中存在着FOXM1表达水平不同的细胞亚群，且 FOXM1高表达的乳腺癌细胞亚群具有肿瘤干细胞的特征。转录因子FOXM1可直接通过调节乙醛脱氢酶ALDH1A2基因的表达参与乳腺肿瘤干细胞干性的调节。

目录

英文缩写

第一章 绪 论

1.1 乳腺癌

1.2 乳腺肿瘤异质性

1.3 乳腺肿瘤干细胞

1.4 转录因子FOXM1

1.5 本文研究背景及内容

第二章 乳腺癌中FOXM1的表达与乳腺癌干细胞特性相关

2.1 前 言

2.2 实验材料与方法

2.3 结果与讨论

2.4 小 结

第三章 FOXM1增强乳腺肿瘤细胞的干性潜能

3.1 前 言

3.2 实验材料与方法

3.3 结果与讨论

3.4 小 结

第四章 乳腺癌MDA-MB-436细胞中FOXM1High/Low表达细胞亚群的分离及性质鉴定

4.1 前 言

4.2 实验材料与方法

4.3 结果与讨论

4.4 小 结

第五章 MDA-MB-436-FOXM1High与MDA-MB-436-FOXM1Low细胞亚群基因表达分析

5.1 前 言

5.2 实验材料与方法

5.3 结果与讨论

5.4 小 结

第六章 FOXM1促进乳腺癌中ALDH1高表达细胞亚群的形成

6.1 前 言

6.2 实验材料与方法

6.3 结果与讨论

6.4 小 结

第七章 乳腺癌中FOXM1高表达患者具有较差的预后

7.1 前 言

7.2 生物信息学分析

7.3 结果与讨论

7.4 小 结

讨论

结论

展望

参考文献

附录A 攻读学位期间发表的论文目录

附录B 常用缓冲液和试剂配方

致谢