纳米孔单通道记录在金属离子检测中的应用

摘要

水资源是经济和社会可持续发展的重要物质基础之一。研究并发展用于水污染物检测和治理的新型技术，不仅是重大国家需求，也是前沿科学问题。在各类水污染物中，重金属离子是很大一类，由于其难以被微生物降解，且进入人体后会长期积累，因此水体中只要有微量重金属子即可产生很强的毒性效应，对人体危害极大。
　　 本论文拟采用一种新颖的检测技术——纳米孔单分子检测技术用于水污染物中重金属的高灵敏度检测研究。该技术是近二十年发展起来的一种崭新的单分子检测技术，但目前主要应用于DNA分子的测序研究，将其应用于重金属离子检测的研究报道很少。
　　 本论文基于Pb2+和Ba2+诱导富G寡核苷酸链形成G-四联体结构的原理，设计筛选出适合在纳米孔单通道记录中检测Pb2+和Ba2+的DNA探针。发展出一种简单快速，灵敏度高、特异性强并在不存在掩蔽剂时可以同时检测Pb2+和Ba2+的单分子检测方法。
　　 论文第四章，合成了对稀土金属离子有配位作用的邻羧基苯甲醛-2-吡咯甲酰腙，并证明了其是潜在的可应用于纳米孔单通道记录系统检测稀土金属离子的分子探针。
　　 论文具体内容如下:
　　 一、构建适合Pb2+，Ba2+检测的纳米孔单通道记录检测系统。
　　 在TBA和PS2.M两段DNA序列的基础上，设计了4条能与Pb2+形成G-四联体的DNA探针，采用α-溶血毒素蛋白纳米孔，筛选出了效果最明显的DNA1——(A)30GTGGGTAGGGCGGGTTGG(A)30作为进一步研究检测Pb2+和Ba2+的DNA探针。选择0.5M(CH3)4NCl作为缓冲液盐，在+180mV/+200mV电压下记录电流变化，构建了适合Pb2+，Ba2+检测的纳米孔单通道记录检测系统。
　　 二、利用该检测系统，实现Pb2+和Ba+单独存在时的定性和定量检测。采用圆二色光谱(CD)研究了DNA1与Pb2+和Ba2+的相互作用，结果表明Pb2+和Ba2+都能诱导DNA1形成G-四联体，而且Pb2+结合DNA1的能力强于Ba2+。相互作用的强弱导致DNA1、Pb2+-DNA1、Ba2+-DNA1三者穿越蛋白纳米孔的阻滞时间的不同，在事件信号的二维分布图中可看出，Pb2+-DNA1和Ba2+-DNA1比对照组多出两个位置有差异的特征信号区域。Pb2+-DNA1的解链时间长于Ba2+-DNA1，事件密度最大的区域分别出现在100ms和10～20ms处。研究了在Pb2+，Ba2+单独存在时，可能的12种干扰离子(K+、Na+、NH4+、Ca2+、Mg2+、Li+、Zn2+、Cd2+、Cu2+、Cr3+、Fe3+、Hg2+)的影响，证实了该方法有高的选择性。通过不对称盐浓度梯度实验，量化特征信号区的事件，使得Pb2+和Ba2+的检测限都降低至0.8nM。
　　 三、实现Pb2+和Ba2+的同时检测。Pb2+和Ba2+与DNA序列探针摩尔比对检测的影响研究表明:DNA1∶Pb2+=1∶1与DNA1∶Ba2+=1∶1叠加信号、DNA1∶Pb2+∶Ba2+=2∶1∶1、DNA1∶Pb2+∶Ba2+=1∶1∶1、DNA1∶Pb2+∶Ba2+=1∶2∶2分峰面积比ABa/APb分别为0.53、0.52、0.35、0.3;说明DNA1和金属离子的比例关系对检测有很大的影响，当DNA1量不变时，ABa/APb的值会随着Pb2+和Ba2+的量变大而变小。通过分峰可实现Pb2+和Ba2+共存时的半定量检测。
　　 四、合成并通过1HNMR、13CNMR表征了邻羧基苯甲醛-2-吡咯甲酰腙。通过元素分析、红外光谱分析对其与13种稀土金属离子(RE=La3+、Ce3+、Pr3+、Nd3+、Sm3+、Eu3+、Gd3+、Tb3+、Dy3+、Ho3+、Er3+、Yb3+、Y3+)的配位作用进行了考察，证明形成的配合物组成为:RE(C13H10N3O3)(C13H11N3O3)·2H2O，结构为:一个稀土离子与两分子酰腙及两分子水配位，其中一个配体失去一个氢原子。说明该酰腙与稀土离子有相互作用，是潜在的可以应用于纳米孔单通道记录系统检测稀土金属离子的分子探针。
　　 综上所述，本论文开发的新的检测的方法可以用于痕量的Pb2+和Ba2+的检测，并对其真正意义上Pb2+和Ba2+的同时检测定量化提供依据。本论文的研究工作拓宽了纳米孔单通道记录技术的应用领域，为更多能与DNA分子结合的物质的检测方法的开发提供了新思路。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 金属离子检测的意义及方法

1．2 纳米孔单通道记录概述

1．3 纳米孔单通道记录在分析检测中的应用

1．3．1 DNA、RNA的检测

1．3．2 多肽、蛋白质、有机聚合物的检测

1．3．3 有机小分子的检测

1．3．4 金属离子的检测

1．4 本论文的主要研究内容

第二章 适于检测Pb2+和Ba2+纳米孔单通道记录检测系统的构建

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验试剂与主要仪器与设备

2．2．2 实验内容

2．3 结果与讨论

2．3．1 金黄色葡萄球菌α-溶血毒素蛋白纳米孔的嵌入

2．3．2 检测Pb2+和Ba2+DNA探针的设计

2．3．3 检测Pb2+和Ba2+缓冲液的选择

2．3．4 检测Pb2+和Ba2+电压的选择

2．3．5 检测Pb2+和Ba2+DNA探针序列的筛选

2．4 小结

第三章 纳米孔单通道记录对Pb2+和Ba2+的检测

3．1 实验部分

3．1．1 实验试剂与主要仪器与设备

3．1．2 实验内容

3．2 结果与讨论

3．2．1 纳米孔单通道记录对Pb2+和Ba2+的检测原理

3．2．2 纳米孔单通道记录对Pb2+和Ba2+检测的选择性

3．2．3 纳米孔单通道记录对Pb2+和Ba2+的定量检测

3．2．4 纳米孔单通道记录对Pb2+和Ba2+的同时检测

3．3 小结

第四章 酰腙探针的合成及其与稀土离子配位作用研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验试剂与主要仪器与设备

4．2．2 实验内容

4．3 结果与讨论

4．3．1 邻羧基苯甲醛-2-吡咯甲酰腙的合成与表征

4．3．2 邻羧基苯甲醛-2-吡咯甲酰腙与稀土离子配位作用研究

4．4 小结

结论

参考文献

致谢

附录A 攻读学位期间发表的论文

附录B 论文中使用的MATLAB程序