烟草糖基转移酶基因sm-Ngt1启动子功能及其在拟南芥中的过表达研究

摘要

糖基转移酶(glycosytransferase，GT)是催化活化的供体糖基转移到特异受体生成糖苷键的酶，广泛存在于生物体。GTs家族是一个超家族，根据GTs的底物特异性和序列同源性以及糖苷键立体化学性质进行分类，GTs 可划分为91个家族。许多植物生理生化反应与糖基化相关，GT 在糖基化过程中扮演重要角色。如GTs 能使一些信号分子或激素糖基化，参与信号调节及植物激素平衡；部分GTs 参与的反应与植物抗性反应有关。 本实验室从烟草中克隆到一个受甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)双重诱导的新糖苷转移酶基因sm-Ngt1，将该基因启动子5’端部分缺失的5个启动子片段取代pCAMBIA1301 质粒的35S 启动子，构建5个以GUS为报告基因的表达载体并转化烟草，研究启动子活性，发现pGTPB(-800～+1)的转化烟草植株受MeJA和SA 诱导后GUS 活性增强，pGTC(-600～+1)具有组成型强启动子的特性。以植物表达载体pCAMBIA1305.1 构建了35S 启动的sm-Ngt1 超表达载体pZ，转化烟草。在阳性转化植株中，在苗期有不同程度的表型变异，主要表现为矮化及叶脉增粗。本实验在此工作基础上，以5’端缺失的启动子构建的pGTPB和pGTPC表达载体采用浸染法转化拟南芥，研究了这两个5’端部分缺失的启动子片段在拟南芥的启动活性；以sm-Ngt1 超表达载体pZ转化拟南芥，研究了对拟南芥生长发育的影响。取得如下结果。 1. pGTPB转化拟南芥，经潮霉素筛选，特异引物PCR 鉴定，得到了大量转基因阳性植株。在获得的阳性转化苗中，取30 株进行水、水杨酸和茉莉酸处理，荧光法检测GUS 酶活，其中16 株转基因苗未诱导时活性较低，受水杨酸和茉莉酸诱导后GUS 活性大大增强，双诱导植株数达50％；2 株无明显变化；3 株受SA 诱导，而受MeJA 抑制；3 株受SA 抑制，但受MeJA 诱导；6 株受SA和MeJA 双重抑制。荧光定量PCR 检测8 株幼苗RNA 水平的表达，结果表明，部分MeJA和SA 诱导后GUS 酶活性增加的植株，gus RNA 表达量也呈现相应的增加趋势。MeJA和SA 处理后，GUS 酶活性减弱的幼苗，gus RNA 表达量也减少。GUS组织染色结果表明，根、茎、叶及花等各部位均能表达，在维管组织染色最深。 2. pGTPC转化拟南芥，经潮霉素筛选，GUS 染色鉴定，获得转基因阳性植株。荧光法检测了24 株转基因阳性植株的GUS 酶活，大部分植株是强表达。 3. Sm-Ngt1 超表达载体转化拟南芥，获得一定数量的阳性转化植株。RT-PCR检测，sm-Ngt1基因在大多数阳性植株中表达。部分植株表现出矮化，叶脉变粗，叶柄变短变粗，腺毛小而且密集。