生肤油防治糖尿病大鼠足溃疡的作用机制研究

摘要

研究背景：
　　糖尿病足溃疡（Diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病引起的严重并发症之一。据统计住院人数占糖尿病住院总人数的12.4％，每年的截肢患者中约50%发生于糖尿病足溃疡患者，是非外伤性致残的主要原因[1,2]。西医常采用内服降血糖药物或外科手术改善足溃疡，存在副作用大，手术费用昂贵等问题；传统中医多采用辩证论治的外治法对症治疗，收效甚佳，应用前景广阔。目前临床医学常结合控制血糖的基础治疗和直接作用于糖尿病足局部病灶中药外用，可使药物直达病灶，解决由于肢体末端血液循环差因而全身药物不能到达的弊端，采用多靶点治疗促进糖尿病足溃疡愈合，使局部发生溃疡、化脓、腐烂等症状的时间明显缩短，并且安全性较高，尚未见副作用的报道，病人乐于接受治疗。由于糖尿病足溃疡与普通创面不同，慢性难愈，愈后易留疤痕，给患者身体和精神上带来巨大的痛苦，也给家庭和社会造成严重的经济负担[3]。因此，开发能够兼备预防糖尿病早期末梢循环障碍，延缓足溃疡发生的同时又能有效促进足溃疡发展期创面愈合，减轻患者痛苦，降低截肢率的新药已成为治疗糖尿病足溃疡的重点及难点。
　　前期实验证实了外用生肤油具有益气活血、祛瘀生肌之功效，能促进Ⅲ度烧伤创面快速愈合，其机制涉及修复末期下调环氧化酶2（COX-2）、β-连环素（β-catenin）的高表达，这些提示了生肤油对病理性创面修复具有明显的疗效。本实验通过建立糖尿病足溃疡早期及发展期的大鼠模型，检测给药前后的足部温度、热痛阈值、创面大体变化、创面面积变化及修复末期创面组织中相关蛋白COX-2、β-catenin及VEGF的表达探讨生肤油防治糖尿病足溃疡的机制；利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）在细胞实验中模拟糖尿病足溃疡病理修复中的持续炎症状态，通过检测成纤维细胞的迁移能力以及 COX-2、β-catenin的表达变化，探讨成纤维细胞迁移过程中COX-2、β-catenin的调控机制。
　　目的：
　　本课题主要研究生肤油预防糖尿病大鼠足溃疡早期的发生，促进糖尿病足溃疡创面愈合及其作用机制；同时探讨 COX-2、β-catenin的异常调节与成纤维细胞迁移之间的关系，为今后进一步推广生肤油在临床上的应用提供科学的依据。生肤油防治糖尿病大鼠足溃疡的作用机制研究
　　方法：
　　1、采用腹腔注射链脲佐菌素（STZ）结合足部低温诱导，建立糖尿病大鼠足溃疡早期模型。随机将大鼠均分为非糖尿病组、糖尿病未治疗组、二甲双胍组、生肤油以及生肤油+二甲双胍组，并根据分组给予生理盐水或二甲双胍灌胃（200 mg/kg，1次/天）同时足底涂抹麻油或生肤油（0.15 ml/cm2，1次/天）治疗3周。采用红外测温仪及足底测试仪分别测定给药前及给药1、2、3周后大鼠双足底温度和热痛阈值，对数据行重复测量方差分析。
　　2、采用腹腔注射STZ结合足底高温蒸汽烫伤（面积约37 mm2）建立糖尿病大鼠足溃疡发展期模型。根据临床采用口服降糖药全身给药、局部外用治疗以及两者相结合的治疗原则设计了本实验的给药分组。随机将大鼠均分为非糖尿病组、糖尿病未治疗组、二甲双胍组、生肤油及生肤油+二甲双胍组，并根据分组给予生理盐水或二甲双胍灌胃（200 mg/kg，1次/天）同时足底涂抹麻油或生肤油（0.15 mL/cm2，1次/天）治疗35天。治疗3、7、21、35天观察各组创面大体变化并记录创面面积；治疗35天处死各组大鼠，取创面全层皮肤组织，部分切片经H&E染色后行组织形态学观察，部分切片用于进行免疫组织化学染色，采用多光谱显微成像系统定量创面组织中环氧化酶2（COX-2）、β-连环素（β-catenin）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达，对数据行重复测量方差分析及双因素方差分析。
　　3、利用脂多糖（LPS）诱导结合细胞迁移实验，模拟糖尿病足溃疡创面的病理性愈合过程，并检测成纤维细胞的迁移能力以及COX-2，β-catenin的表达。分别给予COX-2的抑制剂NS398，β-catenin的抑制剂DKK-1后观察24 h内细胞迁移的距离，Western blotting法检测COX-2、β-catenin的相对表达水平。对数据行单因素方差分析。
　　结果：
　　1、生肤油能改善糖尿病足溃疡早期足部低温及痛觉迟钝：给药2、3周，生肤油+二甲双胍组大鼠足温有所升高并明显高于糖尿病未治疗组，且与非糖尿病组无明显差异；给药3周，二甲双胍组、生肤油组大鼠足温均与非糖尿病组的无明显差异。给药前、后3周期间，糖尿病未治疗组大鼠始终呈高痛阈值，二甲双胍组、生肤油组、生肤油+二甲双胍组大鼠热痛阈值均逐步降低。
　　2、生肤油能促进糖尿病足溃疡发展期创面愈合：①创面大体观表明治疗3~35天，生肤油组及生肤油+二甲双胍组创面愈合优于其它组。②创面面积比较结果表明治疗7 d，5组大鼠创面面积均明显增大。治疗21 d、35 d糖尿病未治疗组大鼠创面面积始终最大且明显大于非糖尿病组，生肤油组、生肤油+二甲双胍组大鼠创面面积缩小并明显小于糖尿病未治疗组，且与非糖尿病组无显著性差异。③H&E染色结果显示，生肤油组及生肤油+二甲双胍组创面皮肤结构较为完整，真皮层炎性细胞浸润较少，创缘处胶原纤维排列较整齐。④免疫组织化学染色及定量结果显示，治疗35d相比糖尿病未治疗组，生肤油组及生肤油+二甲双胍组创面组织中 COX-2表达明显下调，VEGF的表达明显上调，生肤油组中β-catenin的表达明显下调。
　　3、LPS呈剂量及时间依赖的诱导成纤维细胞的迁移，且伴随了 COX-2、β-catenin的过表达。而通过抑制 COX-2、β-catenin的过表达抑制了成纤维细胞的过度迁移。
　　结论：
　　1、生肤油可改善糖尿病早期因末梢循环障碍引起的足部皮温降低及痛觉迟钝。
　　2、生肤油通过下调创面组织中COX-2、β-catenin的表达、上调创面组织中VEGF的表达，延缓了足溃疡发展期的恶化，促进糖尿病足溃疡的愈合。
　　3、LPS上调COX-2、β-catenin的表达，两者相互作用相互影响形成回路，促进成纤维细胞的过度迁移。而通过下调COX-2及β-catenin的过表达，可抑制成纤维细胞的过度迁移。

目录

声明

缩略词表

第1章 绪 论

1.1 糖尿病足溃疡的概述

1.2 糖尿病足溃疡的形成机制

1.3 中、西医治疗糖尿病足溃疡的研究现状

1.4 Wnt/β-catenin及COX-2在病理性修复中的调节作用

1.5 生肤油促进深度烫伤创面修复的前期研究

1.6 课题研究内容及意义

第2章 生肤油对糖尿病大鼠足溃疡的防治作用及机制

2.1材料与仪器

2.2 方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第3章 Wnt/β-catenin及COX-2在成纤维细胞迁移能力中的调节作用

3.1材料与仪器

3.2实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

致谢

附录：攻读学位期间所发表的学术论文