榼藤子酸的提取分离及抗糖尿病活性研究

摘要

榼藤子为豆科榼藤子属植物榼藤子 Entada phaseoloides(Linn.) Merr.的干燥种仁，系傣族地区的习用药材。主要用于治疗痔疮、胃痛、便秘、水肿等病症。现代药理学研究表明，榼藤子属植物具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗炎镇痛等多种生物活性。对其化学成分的研究表明，三萜皂苷类成分是榼藤子的主要活性成分。本课题组前期研究表明榼藤子皂苷具有一定的降血糖活性,能显著降低T2DM大鼠空腹血糖水平和胰岛素水平。榼藤子酸作为榼藤子皂苷的主要苷元形式，且为榼藤子的特征性成分，其是否具有降糖活性尚未见报道。本文通过对榼藤子中榼藤子酸进行提取分离，并通过体内、外实验对其抗糖尿病活性进行系统研究，并初步探讨其作用机制。
　　本研究以榼藤子种仁为材料，采用70％乙醇浸泡提取，醇提物用石油醚萃取去脂后过HP-20大孔树脂柱色谱，以水-乙醇体系进行梯度洗脱，收集50%乙醇部位进一步纯化得到榼藤子总皂苷。采用2N HCl90℃反应2h对总皂苷进行酸水解，水解产物经乙酸乙酯萃取后过 MCI柱色谱进一步分离纯化，用水-乙醇体系梯度洗脱，得到榼藤子酸。采用高效液相色谱法（HPLC）进行纯度分析得榼藤子酸纯度≥98%。
　　采用大鼠骨骼肌细胞L6及胰岛素抵抗HepG2细胞为体外细胞模型探讨榼藤子酸对葡萄糖消耗的影响。结果显示，榼藤子酸能显著提高 L6细胞基础状态及HepG2细胞胰岛素抵抗状态时的葡萄糖消耗量，且呈一定的剂量依赖性。结果提示榼藤子酸可能具有潜在的降糖活性。接着，我们以 L6细胞为研究对象，选取了几种榼藤子酸同类或结构相似的五环三萜类化合物体进行外葡萄糖消耗的对比研究。结果显示，榼藤子酸、熊果酸、齐墩果酸均在一定程度上促进了 L6成肌细胞葡萄糖消耗，显示了良好的体外降糖活性，且榼藤子酸的效果优于熊果酸和齐墩果酸。
　　我们以 L6细胞为靶细胞进行下一步的机制研究。结果显示，榼藤子酸可促进IRAP转膜，间接提示其可能对GLUT4的转位有促进作用。Western blotting结果进一步证实，榼藤子酸可显著增加 GLUT4的蛋白表达水平，并且能显著增加AMPK和ACC的磷酸化水平。结果表明榼藤子酸可能是通过AMPK信号通路介导的GLUT4的转位和表达而增加葡萄糖消耗的。
　　为验证榼藤子酸的体内抗糖尿病活性，我们选取自发性二型糖尿病模型db/db小鼠为动物模型用榼藤子酸（5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg）或二甲双胍（150mg/kg）进行药物干预。连续灌胃6周后，榼藤子酸显著逆转了db/db小鼠血糖持续升高的趋势，并改善了db/db小鼠葡萄糖耐量和胰岛素耐量，降低了其血清TC、TG、LDL-C、TNF-α水平，升高了HDL-C水平。病理组织切片结果显示，榼藤子酸在一定程度上改善了 db/db小鼠肝脏气球样变和脂肪变性，并且对胰岛形态的异常也具有显著的改善作用。对小鼠肝脏 MDA、SOD水平检测结果表明，榼藤子酸显著降低了db/db小鼠肝脏MDA含量，升高了SOD活力水平。Western blotting结果进一步证实，榼藤子酸对db/db小鼠肌肉组织GLUT4蛋白表达具有上调作用。以上结果表明，榼藤子酸发挥体内抗T2DM作用是通过调节血、脂代谢紊乱，改善胰岛素抵抗、保护肝脏及胰岛形态功能以及调控 GLUT4蛋白表达等途径实现的。

目录

第1章 绪 论

1.1 前言

1.2 T2DM概述

1.3 榼藤子简介

1.4榼藤子酸概述

1.5 本研究的目的与意义

第2章 榼藤子酸的提取分离

2.1 前言

2.2 实验材料与仪器

2.3 提取与分离流程

2.3 结论

第3章 榼藤子酸对L6细胞和HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

3.1 前言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 统计学分析

3.5 实验结果

3.6 实验讨论

3.7 实验小结

第4章 榼藤子酸促进葡萄糖消耗的机制研究

4.1 前言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 统计学分析

4.5 结果

4.5 讨论与小结

第5章 榼藤子酸对db/db模型小鼠体内降糖活性研究

5.1 前言

5.2 实验材料

5.3 实验方法

5.4 统计学分析

5.5 结果

5.6 实验讨论

4.7 实验小结

结论

本研究工作的创新点

参考文献

致谢

附录A 攻读学位期间发表的学术论文

附录B: 中英文对照缩略词表