南瓜属植物总RNA的提取及抗氧化酶基因的扩增

摘要

RNA提取是研究基因分离和表达的第一步，从含有多酚、多糖以及次生代谢物质的植物组织中提取RNA存在很多问题，会造成RNA在提取过程中氧化、褐化、降解。为了建立一种经济快速的从南瓜属植物中提取RNA的方法，本文尝试了CTAB法、一步法、尿素/氯化锂法、热酚法、LUG法5种方法，对他们的结果进行比较和改进之后确定了一种适合南瓜和西葫芦组织的RNA提取方法即改良CTAB法。该方法全程只需要2h，通过用等体积的异丙醇在-20℃处理20min来沉淀RNA，用高浓度的NaCl(1.0-2.5M)和醋酸钠来有效的去除多糖类化合物，利用该方法从西葫芦和南瓜叶子以及果肉中成功的提取了总RNA。提出来的RNA很清楚的显示出28s和18s两条链，RNA的产量是210-250μg/g鲜重，A260/280是2.08-2.15，A260/230是2.0-2.12，提出来的RNA是没有多酚、多糖、蛋白质污染的高纯度的RNA。
　　同时验证了RNA的保存方法，将RNA沉淀浸入无水乙醇中然后放在-80℃冰箱中保存，静置6个月后RNA质量无变化。建立了一种简并引物设计的方法:在NCBI中搜索出同一个属中15种植物中同一种蛋白质的序列，然后在NCBI中找出对应的eDNA序列，利用CLCMain Workbench6，通过sequence alignment，结合引物设计的原则，设计出了南瓜和西葫芦组织中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶基因的简并引物。
　　将南瓜和西葫芦叶子和果肉中的Cu/Zn-SOD、Mn-SOD片段基因扩增了出来以及叶子中的过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶片段基因也扩增出来。获得了南瓜和西葫芦的叶子以及果肉中Cu/Zn-SOD的cDNA序列，并将西葫芦果肉中的Cu/Zn-SOD片段基因投递到NCBI，获取登录号为KF192818。同时验证了同一基因在植物体的不同部位会出现差异性表达。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 生物体内重要的抗氧化酶

1．2．1 超氧化物歧化酶的研究进展

1．2．2 过氧化氢酶和过氧化物酶的研究进展

1．2．3 谷胱甘肽过氧化物酶的研究进展

1．3 SOD在医学上的应用

1．3．1 SOD的抗辐射作用

1．3．2 SOD与糖尿病的慢性并发症

1．3．3 SOD与肺病

1．3．4 SOD的抗炎作用

1．3．5 SOD在缺血再灌流损伤中的作用

1．3．6 SOD在心血管疾病中的作用

1．3．7 SOD在脑组织中的调控作用

1．3．8 SOD对肿瘤的作用

1．4 SOD在工业上的应用

1．4．1 SOD在食品工业上的应用

1．4．2 SOD在日化工业上的应用

1．5 SOD在农业上的应用

1．6 从南瓜属植物中提取RNA

1．7 RT-PCR

1．7．1 cDNA的合成方法

1．7．2 简并引物的设计方法

1．7．3 PCR方法的介绍

1．8 测序

第二章 材料和方法

2．1 试验材料

2．2 主要试剂及仪器

2．3 RNA提取及鉴定

2．3．1 RNase的去除

2．3．2 RNA的提取

2．3．3 RNA完整性的检测

2．3．4 RNA浓度和纯度的检测

2．4 cDNA的合成

2．5 目的基因的合成

2．5．1 引物设计原则

2．5．2 简并引物的设计

2．5．3 PCR的条件

2．6 凝胶DNA回收

2．7 序列验证

2．7．1 T-vector的模式图

2．7．2 T／A克隆

2．7．3 测序

第三章 结果与分析

3．1 南瓜属植物总RNA提取方法的建立

3．1．1 RNA提取方法研究

3．1．2 RNA提取方法的确定

3．2 RNA的浓度与纯度

3．3 目的基因的分离

3．3．1 简并引物的设计

3．3．2 PCR条件的研究

3．4 测序结果

3．4．1 西葫芦叶子中的Cu／Zn-SOD基因

3．4．2 西葫芦果肉中的Cu／Zn-SOD基因

3．4．3 南瓜叶子中的Cu／Zn-SOD基因

3．4．4 南瓜果肉中的Cu／Zn-SOD基因

第四章 讨论

4．1 南瓜属植物总RNA提取

4．2 防止RNA的降解与损失

4．3 PCR的方法

第五章 结论

参考文献

硕士期间发表论文情况

致谢