TERT端粒酶非依赖机制与丙烯酰胺诱导的神经元损伤

摘要

目的:
　　研究端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)是否参与丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)诱导的大鼠脑皮层神经元的损伤作用及其可能的作用机制。
　　方法:
　　1.动物实验分组:将16只雄性SD大鼠随机分为:正常组,ACR低剂量组, ACR中剂量组,ACR高剂量组。其中正常组注射生理盐水,ACR低、中、高剂量组分别隔天腹腔注射注射等体积不同浓度的ACR,其剂量分别为30mg/kg,40mg/kg,50mg/kg。连续一个月,观察各组中大鼠的体重变化及活动情况。
　　2.ACR对大鼠脑神经元凋亡的影响:腹腔注射ACR连续一个月后,将大鼠处死。每组选择一半大鼠用多聚甲醛固定,取脑组织做切片,用TUNEL免疫荧光检测大脑脑损伤情况及皮层神经元凋亡情况;另一半大鼠提取脑组织匀浆,用Western blot检测脑组织中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Bcl-2的表达以及对TERT表达的影响。
　　3. ACR对大鼠脑皮层神经细胞凋亡作用的影响:提取SD大鼠乳鼠的大脑皮层神经元细胞,将细胞分为四组,正常组,ACR低剂量组,ACR中剂量组,ACR高剂量组。其中正常组加入PBS溶液,低、中、高浓度组分别用2.5mM/L,5mM/L,10mM/L浓度的ACR干预细胞24hACR处理后的细胞,采用MTT法以及流式细胞术(FCM)测定细胞存活率以及细胞凋亡率。用Western blot检测细胞中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3,Bcl-2的表达。
　　4.ACR对大鼠脑皮层神经细胞中TERT表达的影响:分别提取细胞总蛋白,胞浆蛋白以及线粒体,用Western blot及Real-time PCR检测细胞水平中TERT的蛋白水平以及mRNA水平表达。
　　7.ACR对大鼠脑神经元皮层细胞( reactive oxygen species,ROS),超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD),丙二醛(malondialdehyde,MDA),谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)活性以及谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量的影响:用ACR含量分别为2.5mM/L,5mM/L,10mM/L的浓度干预神经细胞24h,提取皮层神经细胞中的线粒体,检测线粒体中SOD和GSH-PX的活性以及GSH和MDA含量,用流式细胞术检测细胞中ROS的表达。
　　结果:
　　1.SD大鼠隔天腹腔ACR注射一次,连续一个月后,正常组的大鼠体重在一个月内持续稳定的增长,而 ACR组的增长速度小于正常组,体重从第二周起变化显著,并以高剂量组的变化最为明显。ACR组大鼠后肢明显无力,嗜睡。Tunel免疫荧光的结果显示,正常组脑皮层区域中出现少量凋亡细胞;而与正常组相比, ACR(低剂量、中剂量、高剂量)组中Tunel阳性细胞数逐渐增加,其中以高剂量组增加最为显著;Western blot结果显示大鼠脑组织中Cleaved Caspase-3表达随着ACR剂量的增加而增加,而Bcl-2以及TERT的表达却随着ACR剂量的增加而表达降低。
　　2..在体外试验中,ACR干预神经元皮层细胞24小时后,MTT法检测细胞存活率发现 ACR(2.5mM/L,5mM/L,10mM/L)组与正常组相比,其细胞存活率显著降低;FCM检测结果显示:与正常组比较,ACR组(2.5mM/L,5mM/L,10mM/L)细胞凋亡率明显增加(P<0.05),且呈剂量依赖性。细胞中 Cleaved Caspase-3表达随着ACR浓度增加而增加,而Bcl-2的表达却随着ACR浓度的增加而表达降低。Western blot及Real-time PCR结果均显示细胞中ACR低中剂量组TERT表达上升,ACR高剂量组的TERT的表达下降,而胞浆蛋白中TERT的表达却无显著变化。
　　3.ROS,SOD,GSH-PX活性及GSH和MDA含量的检测结果显示:与正常组比, ACR处理组线粒体中SOD、GSH-PX活性及GSH含量随着ACR浓度增高明显降低,而MDA含量则明显升高(P<0.05),且呈剂量依赖性。ROS也随着ACR含量增加而表达升高。
　　结论:
　　1.在整体动物水平, ACR能促进大鼠脑神经细胞凋亡,上调 Cleaved Caspase-3的表达而下调 Bcl-2的表达,说明 ACR的神经毒性作用可能是通过caspase途径以及线粒体的调控触发凋亡的。
　　2.ACR能上调细胞中ROS的含量,降低线粒体中SOD, GSH-PX活性及GSH含量,增加MDA含量,说明ACR能降低细胞抗氧化的能力,通过产生氧自由基诱导氧化应激的损伤。
　　3.在整体动物水平上,ACR下调TERT的表达;在细胞水平上,ACR低中剂量诱导TERT的表达,高剂量降低TERT的表达,但胞浆中TERT的表达无显著变化,说明ACR对TERT的影响作用可能主要存在于线粒体中,并且.线粒体TERT可能是以一种代偿机制反应参与ACR介导的神经元细胞凋亡。

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英文缩写对照

第一部分 丙烯酰胺对大鼠脑神经元凋亡的影响

1材料与仪器

1.1主要实验试剂

1.2主要试剂的配制

1.3实验仪器

2方法

2.1动物处理

2.2灌流固定脑组织

2.3取脑

2.4脑组织匀浆提取蛋白

2.5 石蜡包埋切片

2.6 TUNEL免疫荧光

2.7 Western blot分析

2.8 统计学分析

3 结果

3.1大鼠体重及活动情况

3.2 Tunel法检测大鼠脑神经细胞凋亡

3.3 ACR对大鼠脑神经元凋亡相关蛋白以及TERT表达的影响

4讨论

第二部分 丙烯酰胺对大鼠脑皮层细胞凋亡、增殖、氧化应激以及TERT表达的影响

1材料与仪器

1实验试剂

1.2溶液试剂配制

1.3实验所需仪器

2 方法

2.1 原代海马细胞的分离及培养

2.2 MTT实验

2.3流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡

2.4 Western blot检测

2.5 ROS检测

2.6 Real-Time PCR

2.7 SOD、MDA、GSH和GSH-PX检测

2.8 TRAP－PCR银染法端粒酶活性检测

2.9统计学分析

3 结果

3.1 ACR对大鼠神经元细胞增殖及凋亡的影响

3.2 ACR对大鼠神经元皮层细胞中活性氧含量、线粒体中SOD、MDA、GSH和GSH-PX表达的影响

3.3 丙烯酰胺对大鼠脑神经元细胞Cleaved Caspase-3 和Bcl-2表达的影响

3.4 丙烯酰胺对大鼠神经元细胞TERT表达的影响

4.讨论

参考文献

致谢

附录1攻读硕士学位期间发表的论文

附录2攻读硕士学位期间参加的科研项目