探讨ARM结构的缺失对SPAG6在真核细胞中定位的影响

摘要

目的:构建 SPAG6基因全长及六个不同长短 ARM序列的真核表达载体pEGFP-N2-SPAG6-△ARM,探讨融合蛋白在细胞内表达及定位。观察全长及六个ARM结构缺失后对真核细胞CHO细胞中SPAG6蛋白定位的影响。
　　方法:1.利用NCBI数据库,寻找小鼠SPAG6蛋白的保守功能区,分析全长蛋白序列,检索出SPAG6有七个ARM区域;
　　2.以健康成年雄性小鼠的睾丸组织为来源,建立小鼠睾丸 cDNA文库;
　　3.以小鼠睾丸 cDNA文库为模板,PCR扩增 SPAG6全长及六个不同长短ARM结构的编码序列;
　　4. TA克隆后测序;
　　5.构建携带不同长短ARM序列的真核表达载体pEGFP-N2-SPAG6-△ARM,对阳性克隆进行酶切和测序鉴定,将构建的重组质粒转染到 CHO细胞中;
　　6.分别提取细胞蛋白进行Western blot检测,利用共聚焦激光扫描显微镜观察七个不同SPAG6/GFP融合蛋白在CHO细胞内的定位。
　　结果:酶切和测序鉴定表明,全长及六个缺失不同长短ARM结构的真核表达质粒构建成功,转染实验发现重组质粒均能够在CHO细胞中表达,但仅全长表达产物定位于微管,缺失任何一个ARM区域都可影响在细胞中的微管定位。
　　结论:SPAG6在真核细胞内的正确定位依赖于全长。该研究为进一步研究SPAG6蛋白的结构与功能奠定基础。

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前言

一、材料

1 主要试剂

2 主要仪器和器材

3实验动物

4载体和菌株

5 主要溶液的配制

二、方法

1查询SPAG6基因图谱，确定ARM的碱基数

2组织总RNA的提取及RT-PCR

3 SPAG6全长及六个缺失ARM基因编码序列的扩增

4TA克隆

5TA克隆连接产物的转化与筛选

6质粒的提取与纯化

7 SPAG6/PCR2.1 TA克隆重组质粒的鉴定

8 真核重组质粒SPAG6/GFP的构建

9 SPAG6/GFP重组质粒的鉴定

10 SPAG6/pEGFP-N2重组质粒转染细胞

三、结果

1 小鼠SPAG6基因序列

2 小鼠SPAG6由7个ARM序列组成

3 提取睾丸总RNA的结果

4 全长及六个缺失ARM结构（七个）的小鼠SPAG6 的PCR结果

5 七个SPAG6/pCR?2.1TA vector重组质粒双酶切鉴定结果

6 七个SPAG6/pCR?2.1TA vector克隆重组质粒测序结果

7 七个SPAG6/pEGFP-N2重组质粒的双酶切鉴定结果

8 七个SPAG6/pEGFP-N2重组质粒的测序结果

9 七个SPAG6/GFP重组质粒转染CHO细胞后的Western Blot结果

10 七个SPAG6/GFP融合蛋白在细胞内的定位结果

四、讨论

五、研究的局限性

六、研究的未来方向

参考文献

附录：质粒载体的图谱

硕士期间参与的科研项目

硕士期间公开发表的论文

综述：

致谢