可结合纤维素的五聚体化单链抗体的异源表达与纯化

摘要

目的:构建可结合纤维素的五聚体化单链抗体原核表达载体系统，并进行融合蛋白的表达与纯化。
　　方法:
　　1.载体构建:利用基因克隆技术通过PCR获得大豆胰蛋白酶抑制剂单链抗体基因片段，并将所得DNA片段分别克隆到含有纤维素结合结构域的原核表达载体pET37b及不含有纤维素结合结构域的载体pET22b上;同时利用PCR技术扩增出大肠杆菌VT1B五聚体化结构域基因片段，再将五聚体化结构域片段插入含有蛋白酶抑制剂单链抗体基因的载体上，获得含有纤维素结合结构域-五聚体化结构域-单链抗体——多组氨酸标签的融合蛋白的原核表达构建体。
　　2.蛋白表达:将所获得的含有目的基因的载体转入大肠杆菌BL21表达菌株中，用0.5mM的IPTG进行诱导。诱导表达一定时间后，收集细胞、超声破碎，收集细胞裂解液和沉淀，鉴定目的蛋白的表达。分离包涵体、用8M尿素溶解包涵体，获得含有目的蛋白的包涵体溶解液。
　　3.蛋白纯化:预处理Ni-NTA树脂柱，将收集的含有目的蛋白的细胞裂解液或包涵体溶解液与Ni-NTA树脂柱进行结合，洗去部分杂蛋白，最后用含有0.4M咪唑的洗脱液将蛋白从用Ni-NTA树脂上洗脱下来，鉴定并保存洗脱下来的初步纯化的目的蛋白。
　　4.蛋白复性:用透析的方法，将尿素变性后的蛋白通过逐步去除尿素，降低变性剂浓度，使恢复蛋白活性。
　　5.亲和层析:将复性的蛋白与纤维素柱共同孵育，利用亲和层析的原理，目的蛋白可与纤维素结合，洗去杂蛋白，将目的蛋白从纤维素柱中洗脱下来，经SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮蓝法染色，比较蛋白与纤维素的亲和力。
　　结果:
　　1.获得多个含有大豆胰蛋白酶抑制剂单链抗体的原核表达载体，包括1）不含有五聚体化结构域、不含有纤维素结合结构域的蛋白酶抑制剂单链抗体表达载体pET22b-1X;2）含有五聚体化结构域、不含有纤维素结合结构域的蛋白酶抑制剂单链抗体表达载体pET22b-260;3）不含有五聚体化结构域、含有纤维素结合结构域的蛋白酶抑制剂单链抗体表达载体pET37b-1X;及4）既含有五聚体化结构域、也含有纤维素结合结构域的蛋白酶抑制剂单链抗体表达载体pET37b-260。
　　2.经诱导得到大量目的蛋白，大部分目的蛋白大量表达在包涵体沉淀中，少部分在上清液中。
　　3.通过Ni-NTA树脂可对目的蛋白进行纯化，但仍然存在大量非特异性蛋白。
　　4.纤维素柱可与有活性的蛋白结合，经过纤维素再次纯化，目的蛋白获得进一步纯化，得到纯度较高的目的蛋白。
　　5.五聚体化融合蛋白对纤维素的亲和力可增强2倍，可进一步提高目的蛋白的纯度。
　　结论:
　　1.纤维素结合结构域-五聚体化结构域-单链抗体融合蛋白可以在大肠杆菌中获得高效表达;
　　2.单链抗体本身及各种融合蛋白在大肠杆菌表达系统中的可溶性受到限制，通过包涵体变性剂处理、纯化并复性操作，融合蛋白的活性可恢复;
　　3.纤维素可纯化可结合纤维素的五聚体化单链抗体;
　　4.五聚体化结构域可增强可结合纤维素的单链抗体融合蛋白与纤维素之间的亲和力，提高纯化效率。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 抗原抗体的亲和层析

1．1．1 多聚体化可以提高抗原抗体亲和力

1．1．2 亲和层析的固相载体对亲和力也起重要作用

1．1．3 纤维素是较好的亲和层析固相

1．2 蛋白酶抑制剂

1．2．1 蛋白酶抑制剂有重要的生物功能活性

1．2．2 BBI是一种大豆蛋白酶抑制剂，在医药上具有抗癌等作用

1．3 研究目的及意义

1．3．1 研究目的及意义

1．3．2 研究技术路线

第2章 大豆蛋白酶抑制剂(BBI)单链抗体(ScFv)与其含五聚体结构域的载体构建

2．1 实验材料

2．2 实验仪器与主要试剂

2．2．1 实验仪器

2．2．2 软件工具

2．2．3 主要试剂

2．3 实验方法

2．3．1 感受态的制备

2．3．2 PCR

2．3．3 酶切

2．3．4 核酸电泳胶

2．3．5 连接

2．3．6 转化

2．3．7 筛单克隆抗体

2．3．8 中提质粒

2．4 实验结果与分析

2．4．1 大豆蛋白酶抑制剂(BBI)与其含五聚体结构域的载体构建

2．4．2 大豆胰蛋白酶抑制剂(BBI)与其含五聚体结构域的PCR扩增和酶切验证

第3章 可结合纤维素的五聚体化单链抗体的表达与纯化

3．1 实验材料

3．2 实验仪器与主要试剂

3．2．1 实验仪器

3．2．2 主要试剂

3．3 实验方法

3．3．1 诱导原核表达

3．3．2 超声

3．3．3 Ni-NTA纯化

3．3．4 透析复性

3．3．5 与微晶纤维素(MCC)亲和能力检测

3．3．6 SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法(coomassie blue staining)检测

3．4 实验结果与分析

3．4．1 可结合纤维素的五聚体化单链抗体的表达

3．4．2 pET-22b-1X与pET-22b-260不可结合纤维素的五聚体化单链抗体的表达

3．4．3 可结合纤维素的五聚体化单链抗体的纯化与复性

3．4．4 pET-22b-1X与pET-22b-260不可结合纤维素的五聚体化单链抗体的纯化

3．4．5 可结合纤维素的五聚体化单链抗体的亲和力检测

第4章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

致谢

参考文献

综述 Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制剂研究进展

参考文献

附录1 攻读硕士学位期间发表的论文

附录2 攻读硕士学位期间参加的科研项目