无义突变型荧光素酶稳定表达细胞株的建立

摘要

目的:
　　建立稳定表达含无义突变位点荧光素酶的细胞株，用以筛选新的无义突变通读剂。
　　方法:
　　酶切质粒pGL4-WT和pGL4-MUT，得到野生型和无义突变荧光素酶编码cDNA，分别插入到慢病毒载体pLVX-IRES-Neo多克隆位点。酶切及PCR鉴定后，将重组载体包装成慢病毒颗粒，感染HEK293细胞，单克隆细胞抗性筛选获得稳定细胞株，提取总RNA，经逆转录PCR方法验证荧光素酶mRNA表达。最后用已知阳性无义突变通读剂G418处理细胞，Western blot方法检测处理前后荧光素酶蛋白表达水平，同时分析荧光素酶活性。
　　结果:
　　经酶切获得2.7 kb长野生型和无义突变荧光素酶编码cDNA，与pLVX-IRES-Neo连接获得重组慢病毒载体pLVX-WT、pLVX-MUT，EcoRⅠ单酶切、NheⅠ与BamHⅠ双酶切结果证明序列正确插入，PCR也扩增出目的片段;稳定感染慢病毒的HEK293WT和HEK293MUT细胞经逆转录PCR方法成功检测到荧光素酶mRNA表达;阳性通读剂G418处理细胞后发现，HEK293WT细胞在处理前后均表达荧光素酶蛋白，荧光素酶活性也基本相同，而HEK293MUT细胞在处理前不表达荧光素酶蛋白，无荧光素酶活性，处理后恢复了部分荧光素酶蛋白表达，其荧光素酶活性相当于HEK293WT细胞的20％。
　　结论:
　　成功建立了稳定表达无义突变荧光素酶的细胞株，可用于筛选新的无义突变通读剂。

目录

声明

摘要

前言

第1章 材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 实验对象

1．1．2 实验试剂

1．1．3 实验仪器

1．2 RT-PCR引物

1．3 主要试剂配置

1．4 实验方法

1．4．1 酶切电泳

1．4．2 重组慢病毒载体构建

1．4．3 慢病毒包装

1．4．4 慢病毒稳定感染细胞筛选

1．4．5 逆转录PCR方法检测细胞内荧光素酶mRNA表达

1．4．6 Western blot印迹方法检测细胞内荧光素酶蛋白表达

1．4．7 细胞内荧光素酶活性检测

1．4．8 统计学分析

第2章 结果

2．1 重组慢病毒载体构建

2．2 重组慢病毒载体鉴定

2．3 稳定表达荧光素酶编码序列细胞模型的建立

第3章 讨论

3．1 几种常见通读剂概述

3．1．1 氨基糖苷类抗生素(AGs)及其衍生物

3．1．2 小分子化合物

3．2 通读活性检测方法概述

3．3 本研究建立方法的优点

第4章 结论与展望

参考文献

综述 基因治疗药物无义突变通读活性检测方法的研究进展

致谢

附录1 攻读硕士学位期间发表的论文

附录2 攻读硕士学位期间参加的科研项目