一种通过GFP结合蛋白强化GFP三分子荧光互补作用方法的建立与验证

摘要

目的:
　　将改造后的GFP（super-fold GFP，简写为sfGFP）作为三分子荧光互补方法的基础，通过应用多种GFP结合蛋白，观察其对荧光互补的影响，筛选并验证可强化荧光互补作用的GFP结合蛋白，优化GFP三分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中的应用。
　　方法:
　　1.绿色荧光蛋白筛选:细胞转染实验检测，选取野生型GFP(EGFP)与结构改造后的superfolderGFP(sfGFP)相比下，荧光强度的差异。
　　2.构建我们自己的三分子荧光互补技术体系:将sfGFP拆分为三部分（GFP1-9，GFP10和GFP11），建立GFP三分子荧光互补作用的实验体系。
　　3.GFP结合蛋白的筛选:利用多种GFP结合蛋白在细胞水平对GFP三分子荧光互补作用进行检验，筛选出可强化荧光互补作用的GFP结合蛋白;通过GFP结合蛋白与重组装的GFP共定位，探索GFP结合蛋白是否可以结合到三拆分后重新组装的GFP上去;再通过体外实验对细胞实验结果进行验证;最后通过GFP结合蛋白与GFP的结合实验，发现GFP结合蛋白与GFP的结合位点。
　　4.共聚焦研究GFP重组装的定位能力:以LNMB1为研究对象使用共聚焦显微镜研究重新组装的绿色荧光是否与具有特征性定位的蛋白位置相同。
　　5.GFP三分子荧光互补技术的衍生:将三分子互补技术拓展到五分子互补，并进行检验。
　　结果:
　　1:通过细胞实验得出sfGFP比野生型EGFP具有更强的荧光，推断sfGFP更加适合用于研究。
　　2.成功构建GFP三分子荧光互补技术体系，三拆分后的GFP可以通过相互作用的蛋白牵引，重新组装得到绿色荧光。
　　3.发现了三种GFP结合蛋白，DARPin-GFP、GFP-enhancer和NbsfGFP能够在细胞中对三拆分后的GFP重组起到2-4倍的加强效果;GFP结合蛋白与GFP可共定位，推论出，是GFP结合蛋白的直接结合导致GFP荧光强度增强，而排出其它增强因素;体外实验进一步证实了细胞实验结果;而且也揭示了GFP结合蛋白与GFP结合部位与GFP10-11这段结构有紧密联系。
　　4.激光共聚焦观察，结果未发现重新组装的GFP定位到具有特征性的核膜(LNMB1)上，猜测，也许是实验细胞选取或者是融合蛋白的顺序影响了实验结果。
　　5.GFP三分子荧光互补衍生成5个分子，无荧光，或许是蛋白较多，空间位阻效应较严重，阻碍了GFP重新结合成完整的荧光分子。
　　结论:
　　通过荧光对比，我们锁定了荧光强度较高的绿色荧光蛋白sfGFP，以它为基础成功的构建了三分子荧光互补技术模型，并成功筛选了3种对GFP三分子荧光互补技术具有加强效果的GFP结合蛋白，通过体外实验验证了这三个GFP结合蛋白、探索了GFP结合蛋白与GFP的结合位点，将其应用于蛋白质-蛋白质相互作用研究可能提高检测的效率和灵敏度。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 绿色荧光蛋白

1．1．1 GFP的发现

1．1．2 GFP的性质及研究现状

1．1．3 GFP的改进

1．2 GFP双分子荧光互补技术(BiFC)

1．2．1 GFP双分子荧光互补技术的发现和应用

1．2．2 GFP双分子荧光互补技术的改进

1．3 GFP三分子荧光互补技术

1．3．1 GFP三分子荧光互补技术的提出

1．3．2 GFP结合蛋白

1．4 研究的目的及意义

第2章 实验方法与材料

2．1 实验准备

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂及配方

2．1．3 实验仪器

2．1．4 实验操作方法

2．1．5 其他

2．2 实验方法

2．2．1．1 sfGFP与EGFP载体的构建

2．2．1．2 293T细胞培养

2．2．1．3 sfGFP与EGFP质粒单独转染及荧光观察

2．2．2．1 GFP三分子荧光互补实验方法的构建

2．2．2．2 载体构建

2．2．2．3 细胞转染检测GFP三分子荧光互补技术

2．2．3．1 多种sfGFP结合蛋白载体的构建和筛选

2．2．3．2 GFP结合蛋白与GFP的共定位

2．2．3．3 sfGFP结合蛋白与GFP拆分后重组装的验证

2．2．3．4 通过体外实验探索GFP与GBP的结合位点

2．2．4．1 载体构建

2．2．4．2 激光共聚焦对GFP定位功能的研究

2．2．5．1 载体构建

2．2．5．2 五聚体实验体系构建

2．2．5．3 五聚体实验体系实验

第3章 实验结果及分析

3．1．1 sfGFP与EGFP载体构建结果

3．1．2 sfGFP与EGFP质粒单独进行细胞转染后荧光对比

3．2．1 三分子荧光互补技术基础质粒构建结果

3．2．2 GFP三分子荧光互补技术检测

3．3．1 多种sfGFP结合蛋白载体的构建和筛选结果

3．3．2 GFP结合蛋白与GFP的共定位结果

3．3．3 GFP结合蛋白与GFP拆分后重组装的验证

3．4．1 体外实验对GFP与GBP的结合位点的探索

3．4．2 载体构建结果

3．4．3 激光共聚焦对GFP定位功能的研究

3．5．1 载体构建

3．5．2 五聚体实验体系构建

3．5．3 五聚体实验体系实验

第4章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

攻读硕士学位期间参加的科研项目