胞嘧啶脱氨酶APOBEC3G抗乙型肝炎病毒的实验研究

摘要

APOBEC3G(载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G)是一种RNA/DNA编辑酶，具有胞苷脱氨酶活性，可使胞嘧啶(C)脱氨基变为尿嘧啶(U)，从而诱导病毒基因组发生碱基突变，导致病毒整个复制周期终止，具有很强的抗逆转录病毒活性。研究证实:APOBEC3G能抑制vif缺陷人类免疫缺陷病毒(HIV)-1及乙型肝炎病毒(HBV)复制。然而，APOBEC3G抑制HBV复制的具体作用机制，APOBEC3G基因在人体细胞中的其它生物学功能及其作用机制尚不清楚。另外，正常情况下，由于肝细胞不表达APOBEC3G或表达量相对很低，因此在HBV感染过程中，不同临床转归类型的慢性HBV感染患者之间，外周血及肝细胞中APOBEC3G表达是否会存在差异，APOBEC3G是否在慢性HBV感染患者机体内发挥了抗HBV作用，目前也不清楚。基于上述研究背景，本研究首先构建表达APOBEC3G蛋白的重组真核表达载体，并将其转染入HepG2.2.15细胞中，在体外初步探讨APOBEC3G对HBV复制表达的影响，观察HepG2.2.15细胞在高表达APOBEC3G后，APOBEC3G埘细胞生长迁移能力、细胞周期和凋亡现象等生物学行为的影响。接着，观察APOBEC3G基因在不同慢性HBV感染类型（慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化、HBV相关性肝癌）患者的外周血单个核细胞(PBMC)及肝组织中的表达水平及其细胞内定位。最后，通过体内外实验探讨Janus激酶-信号传导和转录激活子(JAK-STAT)信号传导系统是否参与了APOBEC3G基因的转录调节，以及慢性乙型肝炎(CHB)患者发生干扰素抵抗的分子机制。 (1)APOBEC3G基因对HepG2.2.15细胞生物学行为的影响:应用RT-PCR法从人PBMC中扩增APOBEC3G基因，分子克隆法构建表达APOBEC3G蛋白的真核表达载体pcDNA3.1-APOBEC3G，并应用脂质体法将pcDNA3.1-APOBEC3G转染入HepG2.2.15细胞中，Western-blot鉴定细胞中APOBEC3G蛋白的表达。ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平，实时定量PCR检测HBV DNA和HBV mRNA水平。应用有限稀释法筛选出高表达APOBEC3G的HepG2.2.15细胞，并通过Western-blot鉴定。应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡;应用MTT法检测细胞株生长能力;应用划痕法观察细胞迁徙运动能力。结果显示:酶切鉴定证实APOBEC3G真核表达载体被成功构建，Western-blot证实APOBEC3G蛋白可在HepG22.2.15细胞中表达。转染APOBEC3G重组质粒的HepG2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg、HBV DNA及HBVmRNA水平均明显低于未转染重组质粒的HepG2.2.15细胞。pcDNA3.1-APOBEC3G转染的HepG2.2.15细胞、空载体pcDNA3.1转染的HepG2.2.15细胞与未转染质粒的HepG2.2.15细胞（空白对照）比较，细胞周期无明显变化[各期细胞所占比例分别为:G0/G1:（64.27±1.26）％vs（64.18±1.24）％vs(64.09±1.30)％,P＞0.05;S:(23.16±1.38)％vs(22.67±1.41)％vs(23.27±1.43)％，P＞0.05;G2/M:(11.36±1.26)％vs(11.84±1.31)％vs（11.37±1.22）％，P＞0.05]，未见细胞凋亡现象，细胞的生长增殖无明显变化，细胞迁徙运动能力无明显变化[24h及48h细胞迁移抑制率分别为:（7.5±3.7）％vs（10.2±5.5）％，P＞0.05;（13.4±6.5）％vs（17.8±9.2）％，P＞0.05]。实验结果证实:APOBEC3G明显抑制了HepG2.2.15细胞中HBV的复制与表达，高表达APOBEC3G对HepG2.2.15细胞生物学行为无明显影响。成功构建APOBEC3G真核表达载体为深入研究APOBEC3G抗HBV的作用机制奠定实验基础。 (2)APOBEC3G基因在不同慢性HBV感染类型患者中的表达及其细胞内定位:用Western blot及激光扫描共聚焦显微镜，以健康人为对照，检测不同慢性HBV感染类型患者（慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化、HBV相关性肝癌）的PBMC及肝组织中APOBEC3G的表达状况及其亚细胞定位。结果发现:健康人PBMC中APOBEC3G表达水平极低，慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化和HBV相关性肝癌患者PBMC中APOBEC3G蛋白相对表达水平倍数分别为4.12±0.21、4.07±0.28、4.16±0.36、4.21±0.39，均高于健康人。但不同慢性HBV感染类型患者之问两两比较，PBMC中APOBEC3G的表达水平差异无统计学意义（Q值分别为0.931、0.744、1.675、1.675、2.606、0.931，P值均＞0.05）。慢性乙型肝炎患者与HBV相关性肝癌患者比较，肝组织中APOBEC3G表达水平差异无统计学意义(4.40±0.34与4.34±0.43，Q=0.588，P＞0.05)。激光扫描共聚焦显微镜观察显示PBMC中或肝组织中APOBEC3G表达定位于胞质中，胞核中无表达。实验结果提示:慢性HBV感染患者虽有APOBEC3G的表达升高，可能只是HBV慢性感染的伴随表现，APOBEC3G是否参与机体抵御HBV感染的过程尚不清楚。 (3)干扰素-α在体内外诱导APOBEC3G及STAT-1的表达及其机制:应用不同浓度的干扰素(IFN)-α刺激HepG2.2.15细胞，接着应用RT-PCR及Western-blot检测细胞中APOBEC3G及STAT-1的表达水平变化。另外，选取对IFN-α抗病毒治疗完全应答的CHB患者5例（A组）、无应答患者8例（B组），应用RT-PCR及Western-blot检测观察两组患者肝组织中APOBEC3G及STAT-1的表达水平差异。结果发现:IFN-α明显抑制了HepG2.2.15细胞中HBV的复制与表达，同时增强了HepG2.2.15细胞中APOBEC3G基因的表达，并在一定范围内呈现剂量、时间依赖关系。而且，观察到STAT-1的表达也相应地逐渐升高。对IFN-α抗病毒治疗完全应答的CHB患者肝组织中STAT-1及APOBEC3G的表达水平明显高于对IFN-α抗病毒治疗无应答的CHB患者。实验结果提示:诱导细胞内APOBEC3G的表达可能是IFN-α抑制HBV的抗病毒机制之一，并且IFN-α可能通过JAK-STAT信号通道诱导APOBEC3G的表达。而且，对IFN-α抗病毒治疗无应答的CHB患者产生干扰素抵抗的机制可能与STAT-1的表达下调有关。

目录

声明

论文说明

英文缩略词表

摘要

引言

第一部分：APOBEC3G基因对HepG2．2．15细胞生物学行为的影响

材料与方法

第二部分：APOBEC3G基因在不同慢性HBV感染类型患者中的表达及其细胞内定位

材料与方法

第三部分：干扰素-α在体内外诱导APOBEC3G及STAT-1的表达及其机制

材料与方法

参考文献

综述

攻博期间发表的论文

后记