红莲型细胞质雄性不育水稻线粒体蛋白质组学分析

摘要

细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）是一种由细胞质基因控制的花粉败育类型，在高等植物中相当普遍。CMS作为植物杂种优势利用的核心技术，已被广泛应用于杂交种子生产，对世界粮食增产及安全具有非常重要的意义。目前，研究者已经找到大量CMS相关基因，其中一部分通过转基因的方法得到验证，但是我们对CMS蛋白的作用机理仍然知之甚少。水稻红莲型CMS是我国有代表性的细胞质雄性不育类型之一，被广泛应用于三系杂交水稻生产，在全国已经累计推广上亿亩。红莲型水稻的CMS基因orfH79已被克隆，并且通过转基因得到验证，但ORFH79蛋白在不育系线粒体中的结构和功能仍然未知，并且ORFH79蛋白诱导花粉败育的代谢路径也不十分清楚。 本研究中，我们采用差速离心配合Percoll梯度离心技术，从不育系粤泰A(Yuetai A，YtA)及其保持系粤泰B(Yuetai B，YtB)黄化苗中纯化得到线粒体。利用双甲基化标签质谱定量技术，比较研究了二者线粒体总蛋白质组的差异。并且配合蓝绿胶电泳技术（Blue native polyacrylamide gel electrophoresis，BN-PAGE）及2D BN/Tricine-SDS PAGE，比较研究了线粒体蛋白质复合体亚基组成和含量的差异。线粒体蛋白质组学分析共鉴定得到216个水稻线粒体蛋白，其中208个蛋白为线粒体总蛋白，91个蛋白为参与复合体组装的蛋白，83个蛋白同时包含上述二者定量信息。216个线粒体蛋白依功能可分为12类，覆盖绝大部分线粒体功能。肽段数目和BN组分关联分析显示参与同一复合体组装的亚基在BN胶中呈现聚合效应，说明BN胶内蛋白定量信息能间接反映复合体定量信息。深入分析不育系和可育系线粒体总蛋白与复合体的定量信息，我们发现不育系线粒体内大部分蛋白的总含量上升，这些蛋白实际参与复合体组装的含量却低于可育系，其中负责氧化磷酸化的复合体Ⅰ和复合体Ⅴ表现得尤为典型，说明不育系中复合体组装过程存在缺陷。不育系线粒体中大量氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)及胁迫响应相关蛋白普遍上调，从蛋白水平应证了不育系受到严重的氧化胁迫，我们认为氧化胁迫导致不育系中线粒体蛋白氧化受损，进而影响复合体组装。 线粒体总蛋白质组学分析发现，大部分线粒体蛋白变化在2倍以内，然而有4个蛋白在不育系中上调2倍以上，其中2个为花穗性决定类似蛋白(sex determination TASSELSEED2like protein,TS2)(Os07g46920.1,Os07g40250.1),它们上调达到4到6倍。参考玉米中TS2的研究结果，我们认为TS2家族与茉莉酸代谢息息相关。定量分析红莲型水稻黄化苗、绿苗和稻穗中茉莉酸代谢相关物质的含量，发现不育系中茉莉酸的代谢前体13-羟基十八碳三烯酸(Hydroxy octadecatrienoic acid，13-HOTE)和cis-(+)-12-oxophytodienoic acid(OPDA)在苗期显著上调，在减数分裂、四分体、单核和二核时期的稻穗中也呈现急剧的升降变化，说明茉莉酸代谢在不育系水稻发育的各时期均存在异常，这一发现为阐明CMS机理提供了一条非常新颖的线索。 以重组表达的ORFH79蛋白（不含N端与COX1同源的序列）为免疫原，得到抗ORFH79血清。用非离子去垢剂月桂酰基麦芽糖苷处理线粒体蛋白，Western-blot检测发现膜蛋白ORFH79可以完全被其溶解。通过2DBN/Tricine-SDS PAGE及其Western-blot，发现ORFH79至少参与5个复合体的组装，这些复合体大小范围在400kDa到1.2MDa之间，说明ORFH79在不育系中以复合体的形式发挥作用。结合线粒体蛋白质组学和免疫共沉淀分析结果，我们认为ORFH79可能参与复合体Ⅴ的F0亚复合体或者某些未知功能复合体的组装。

目录

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摘要

缩写

第一章文献综述

1植物细胞质雄性不育

1．1 CMS基因的鉴定及特点

1．2 CMS机理假说

1．3红莲型水稻CMS机理研究

2线粒体复合体研究

2．1 Blue-Native PAGE在复合体研究中的应用

2．2植物线粒体OXPHOS复合体及超级复合体

3．定量比较蛋白质组学

3．1双向电泳

3．2质谱定量

3．3双甲基化定量标记技术

4本研究的目的和意义

第二章红莲型CMS水稻线粒体的比较蛋白质组学研究

1材料与方法

1．1材料

1．2方法

2．实验结果

2．1线粒体蛋白质组分析

2．2线粒体蛋白质功能分类

2．3典型线粒体蛋白质的Western-blot验证

2．4不育系和可育系差异蛋白质比较分析

2．5线粒体蛋白质复合体亚基组成比较

2．7不育系和保持系茉莉酸代谢路径分析

3讨论分析

第三章红莲型CMS水稻不育基因orfH79互作蛋白复合体的发现

1材料与方法

1．1材料

1．2方法

2．实验结果

2．1 ORFH79互作蛋白复合体的发现

2．2 ORFH79互作蛋白复合体成分初探

3讨论分析

参考文献

博士期间已发表和待发表的学术论文

致谢