酿酒酵母轴向出芽地标蛋白Bud3p与septin细胞骨架相互作用的研究

摘要

Septin是首先在酿酒酵母中发现的一类重要的细胞骨架蛋白，它通过支架或扩散阻碍的方式参与细胞内的很多重要过程，目前对其高级结构的聚合和解聚机制不是很清楚。Bud3p被septin招募到芽颈并与Bud4p、Axl1p和Axl2p一起组装成轴向地标复合物参与对轴向出芽的控制，但是对其招募机制及地标复合物的组装机制了解不多。另外，Bud3p对septin具有调节作用，表现为过量表达Bud3p会导致芽体变长变粗，出现异常septin螺旋，其原因还有待进一步的研究。为了了解Bud3p如何参与轴向地标复合物的装配特别是与septin的相互作用进而指导轴向出芽和对septin组织的调节，我们构建了Bud3p系列缺失突变体，通过结构-功能分析鉴定其参与芽颈定位、septin组织调节和控制轴向出芽的最短功能结构域。并采用遗传学和生物化学方法对Bud3p与septin的相互作用进行了研究，同时还通过酵母双杂交和多拷贝抑制筛选文库寻找与Bud3p有相互作用的蛋白质。 实验结果表明，在我们构建的Bud3p系列缺失突变体中，有三个片段Bud3p-N/M6(1-858a.a.)、Bud3p-M19(850-1220a.a.)和Bud3p-C2(1221-1466a.a.)都能定位在芽颈处。其中，Bud3p的中部Bud3p-M27(850-1103a.a)在过量表达的情况下能够产生与全长相似的表型:芽体变长变粗及septin组织发生紊乱形成异常septin结构，如螺旋、环、短杆和弧状。Bud3p-M27是我们鉴定出来的具有septin组织调控功能的最短区段。具有芽颈定位能力的Bud3p-N/M6含有控制轴向出芽的功能结构域，在该区段的N端具有两个在Bud3p同源蛋白中保守的DH(Dbl-homology)结构域(259-442a.a)和未知功能DUF3507(Domain of Unknown Function)结构域(21-205a.a)，缺失或突变实验表明DH结构域不参与轴向出芽，而DUF3507结构域是轴向出芽所必需的。我们发现能定位在芽颈的Bud3p-N/M6和Bud3p-M19片段的重叠部分(850-858a.a.)编码一个双性螺旋，该螺旋对于Bud3p-N/M6和Bud3p-M19的芽颈定位及相对应的轴向出芽和septin组织调节功能非常重要，同时研究也表明，双性螺旋加上两侧之一的带正电荷的碱性氨基酸残基基序能够介导Bud3p定位在细胞膜上，并且该部分是Bud3p中指导膜定位的唯一功能结构域。 进一步，我们对Bud3p与septin之间的相互作用关系进行了研究。首先，在组成型表达的情况下，Bud3p不仅与芽颈处的septin骨架共定位，而且还与少部分芽体变长细胞中形成的异常septin螺旋和环能够共定位;其次，我们直接测试了septin亚基SHS1、CDC10和CDC12在Bud3p对septin组织调节中的作用，只有cdc10Δ细胞中芽体增长的现象有部分的减少，并且不能形成异常septin螺旋，其它两个亚基的突变体菌株与野生型细胞表现相似，没有检测到对该过程有明显的挽救作用。进一步我们采用GST pull-down实验研究Bud3p与septin在营养生殖期表达的五个亚基Cdc3p、Cdc10p、Cdc11p、Cdc12p和Shs1p之间的相互作用关系表明，Bud3p能够在体内与Cdc10p和Cdc11p形成复合物，而与其它亚基的相互作用没有检测到。双分子荧光互补实验也证实Bud3p与Cdc10p在体内有相互作用。我们还检测了Swe1p依赖的检测点(Checkpoint)信号通路在过量表达Bud3p诱导芽体变长中的作用，结果表明，SWE1缺失可以部分减少芽体增长细胞的数量，但是不影响异常septin螺旋的形成，然而，能诱导芽体变长的两个片段Bud3p-M和Bud3p-C在swe1Δ细胞中过量表达后细胞形态表现正常，没有出现芽体变长的现象，表明它们过量表达诱导芽体增长的过程依赖于SWE1。有趣的是在Bud3p-M细胞表面septin形成小环状，而在Bud3p-C细胞中septin组织较正常，定位在芽颈，说明Bud3p-M和Bud3p-C与septin相互作用的机制存在区别。 为了深入了解Bud3p与septin相互作用的具体分子机制，我们构建了含BUD3全长及功能片段的Bait质粒，利用酵母双杂交筛选cDNA文库寻找与Bud3p有相互作用的蛋白质。用BUD3-M3/C2区段筛选得到了5'端缺失的BAT2片段，编码一个N端截短蛋白Bat2pΔ1-212。用BUD3-N/M2片段筛选得到了5'端缺失的NIS1片段，编码一个截短蛋白Nis1p△1-52。文献报道，Nis1p定位在芽颈并与各septin亚基有酵母双杂交作用，我们对其与Bud3p的相互作用进行了研究，结果表明，Nis1p的芽颈定位不依赖轴向出芽决定蛋白Bud3p、Bud4p及septin亚基Shs1p，而删除NIS1不影响Bud3p-FL、Bud3p-N/M6、Bud3p-M、Bud3p-M19和Bud3p-C片段的芽颈定位，且含有NIS1的高拷贝质粒也不会影响Bud3p-FL、Bud3p-M和Bud3p-C的芽颈定位。我们发现在shs1Δ菌株中过量表达Bud3p可以造成细胞在37℃不能形成菌落，应用这一系统，我们尝试了多拷贝抑制方法从功能上筛选在该条件下产生的生长缺陷的抑制基因，到目前为止还没有得到感兴趣的基因。最后，我们直接测试了一些与septin组织调控相关的基因如CLA4、GIN4、ELM1和KCC4及septin亚基CDC12，细胞极性建立关键蛋白Cdc42p GTP酶的GAP基因RGA1和BEM3，还有轴向出芽决定基因BUD4、AXL1和AXL2在过量表达BUD3诱导芽体增长中的作用，我们没有检测到上述基因与BUD3在该过程中的相互作用。

目录

声明

本研究创新点

摘要

第一章研究背景

1．septin细胞骨架的结构和功能概述

1．1 septin蛋白的一级结构

1．2 septin在不同物种中的分布

1．3 septin高级结构的聚合

1．4 septin高级结构组织的调控机制

1．5 septin的功能

2．酿酒酵母细胞极性的概述

2．1出芽位点选择

2．2出芽位点选择的分子机制

2．3轴向出芽

2．4双极出芽

3．本课题研究的目的、内容和意义

第二章Bud3p功能结构域的鉴定

1．实验材料

1．1实验所用的菌株及质粒

1．2药品与试剂

1．3培养基和溶液的制备

2．实验方法

2．1构建含Bud3p系列缺失片段的表达克隆

2．2重叠PCR方法构建突变体

2．3酿酒酵母的培养及显微观察

2．4酿酒酵母快速转化

2．5酿酒酵母芽痕染色

2．6酿酒酵母总蛋白的提取

2．7蛋白质印迹实验(Western blot)

3．结果与分析

3．1 Bud3p芽颈定位结构域的鉴定

3．2 Bud3p对septin组织调节结构域的鉴定

3．3 Bud3p膜定位结构域的鉴定

3．4 Bud3p控制轴向出芽结构域的鉴定

4．讨论

4．1 Bud3p芽颈定位由多区段介导

4．2 Bud3p对septin组织的调节作用

4．3双性螺旋的作用

4．4 Bud3p的轴向出芽功能

5．小结

第三章Bud3p与septin相互关系的研究

1．实验材料

1．1实验所用的菌株及质粒

1．2药品与试剂

1．3培养基和溶液的制备

2．实验方法

2．1酿酒酵母基因的敲除及修饰

2．2 GST pull-down实验

2．3双分子荧光互补(BiFC)实验

3．结果与分析

3．1 Bud3p与septin在体内共定位

3．2 Bud3p与septin的遗传相互作用研究

3．3 Bud3p与septin体内相互作用研究

3．4过量表达Bud3p诱导芽体变长部分地依赖Swe1p激酶

3．5双分子荧光互补技术(BiFC)研究Bud3p与septin的关系

4．讨论

4．1 Bud3p与异常septin螺旋共定位

4．2 Bud3p与septin亚基Cdc10p的体内相互作用

4．3 Swe1p在Bud3p诱导芽体变长中的作用

5．小结

第四章通过遗传筛选寻找与Bud3p相互作用的蛋白质

1．实验材料

1．1实验所用的菌株及质粒

1．2培养基和溶液的制备

2．实验方法

2．1酿酒酵母文库转化

2．2酿酒酵母基因组的提取

3．结果与分析

3．1通过酵母双杂交筛选文库寻找与Bud3p相互作用的蛋白质

3．2 Bud3p与Nis1p相互作用的研究

3．3其它遗传学方法筛选与Bud3p功能相关的蛋白

4．讨论

5．小结

研究总结与展望

参考文献

在读期间已发表论文

致谢