吉西他滨增强树突状细胞疫苗抗胰腺癌作用的体外机制研究

摘要

目的: 胰腺癌被公认为预后最差的恶性肿瘤之一，即使手术完整切除，其五年生存率也小于5％。胰腺癌对于化疗和放疗都相对不敏感。至今，吉西他滨(gemcitabine，GEM)仍是治疗进展期胰腺癌唯一有效的单药方案。但是，也仅延长了晚期胰腺癌患者5周的中位生存期。GEM是S期特异性的二氟核苷类似物，可以被去氧胞苷激酶磷酸化成活化的二磷酸及三磷酸代谢产物，这些产物可以抑制核苷酸还原酶和DNA的合成。无论是作为单药还是与其他药物的联合，其治疗不可切除胰腺癌的有效性及安全性已被证实，并成为晚期胰腺癌的标准治疗方式。 自诺贝尔生理学或医学奖获得者拉尔夫·斯坦曼教授用树突状细胞(dendriticcell，DC)治疗自己的胰腺癌，并成功的延长了4年半的生命以来，DC细胞为基础的免疫治疗再次成为研究的热点。作为体内最主要的抗原递呈细胞，DC细胞可以处理并递呈肿瘤抗原至T细胞表面，并因此产生抗原特异的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)抗肿瘤反应。DC细胞疫苗在胰腺癌中的疗效也逐渐被更多的临床研究证实。并且针对前列腺癌的DC细胞疫苗Sipuleucel-T已被美国FDA批准用于临床。以上均显示DC细胞为基础的免疫治疗有望成为治疗胰腺癌的非常有前景的一种治疗方式。 近年来，也渐有报道GEM联合DC细胞肿瘤疫苗治疗胰腺癌能发挥更好的疗效，并显示GEM可以增强DC细胞疫苗的抗肿瘤活性。但是GEM增强DC细胞疫苗抗肿瘤活性的具体机制尚没有完全揭示。本论文通过体外研究，旨在探讨GEM增强DC细胞疫苗抗胰腺癌作用的可能机制。 方法: 1.制备DC细胞和T淋巴细胞:采用密度梯度离心法自健康人血液中提取单个核细胞(PBMCs)。PBMCs在10％FBS1640培养液中贴壁培养4小时，收集贴壁细胞即为DC前体细胞，以20ng/mL GM-CSF和10ng/mL IL-4刺激培养，隔天换液。第五天，加入肿瘤裂解蛋白刺激3小时，再以卡介苗(Bacillus Calmette Gue'rin，BCG)刺激DC细胞成熟。非贴壁细胞采用免疫磁珠分选的方法收集CD3+的T淋巴细胞，以含10ng/mL IL210％FBS1640培养液培养，隔天换液。 2.流式细胞术检测CD11c，CD86，CD80和HLA-DR的表达以反应DC细胞的成熟度，CCK-8实验检测DC细胞对T淋巴细胞增殖的影响，LDH法检测DC细胞活化的CTL抗肿瘤活性。 3.不同浓度GEM处理胰腺癌细胞SW1990，CCK-8实验检测GEM对肿瘤细胞增殖的抑制，流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡及Fas蛋白的表达。借助Fas功能性抗体，探讨Fas通路在GEM增强DC细胞疫苗诱导的抗肿瘤反应中的作用。 4.GEM处理SW1990后的细胞上清，与DC细胞共培养后，流式细胞术检测DC细胞成熟度，CCK-8实验检测DC细胞对T淋巴细胞增殖的影响，LDH法检测DC细胞活化的CTL抗肿瘤活性。 5.Western bbt检测SW1990细胞中Hsp70蛋白的表达，Elisa法检测肿瘤细胞上清中Hsp70的表达。 结果: 1.BCG在感染复数(multiplicity of infection，MOI)=1时，可以显著诱导DC细胞的成熟。BCG诱导成熟的DC细胞可以有效刺激自体T淋巴细胞的增殖，增殖率随DC∶T细胞的比值升高而升高，并且呈时间依赖性。DC细胞与T细胞以1∶10的比例共培养4天，BCG刺激后的DC细胞在效靶比100∶1，50∶1和20∶1时较对照组均可诱导更明显的CTL抗胰腺癌作用。当胆管癌细胞QBC939细胞作为靶细胞时，细胞毒效应明显减低。 2.GEM处理SW1990细胞48小时后，对SW1990细胞的抑制率和凋亡率随GEM浓度的增加而增加。并且SW1990细胞表面Fas蛋白的表达也有升高。在效靶比为100∶1，50∶1和20∶1时，0.025μM GEM处理后的SW1990细胞对于CTL的裂解作用较未处理的SW1990细胞更加敏感。而GEM处理后的SW1990细胞与Fas蛋白的拮抗性抗体共同孵育后，CTL诱导的裂解作用却明显降低。 3.2.5μM GEM处理SW1990细胞48小时后的细胞上清液可以较对照组诱导更多的DC细胞成熟，并且这些DC细胞可以有效刺激T淋巴细胞的增殖，刺激效应随DC∶T比值的增加而增加。所得的CTL在效靶比80∶1，40∶1和20∶1时能够产生特异性的抗SW1990作用。 结论: 1.BCG可以有效刺激DC细胞的成熟，刺激后的DC细胞可以诱导有效的CTL抗肿瘤效应。 2.GEM可以使胰腺癌细胞对于CTL诱导的抗肿瘤效应更加敏感，并且与GEM上调胰腺癌细胞表面Fas的表达有关。 3.GEM处理胰腺癌细胞后的上清液可以通过刺激DC细胞的成熟而诱导有效的CTL抗胰腺癌活性，此过程可能与上清液中含有较高水平的Hsp70有关。

目录

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摘要

英文缩略词表

引言

第一部分 GEM通过上调胰腺癌细胞Fas表达增强BCG活化的DC细胞疫苗的抗胰腺癌作用

材料

方法

结果

讨论

附图

第二部分 GEM处理后的胰腺癌细胞上清可以促进DC的成熟从而诱导有效的抗胰腺癌作用

材料

方法

结果

讨论

附图

参考文献

综述

在学期间发表论文

致谢