长链非编码RNA PCAT7在鼻咽癌细胞中的功能及作用机制研究

摘要

目的: 鼻咽癌是世界范围内尤其是我国潮汕地区最为常见的头颈部肿瘤之一，起病隐匿而致大多数患者发现较晚，预后较为凶险。目前对鼻咽癌的治疗以放疗为主化疗为辅，尽管治疗手段的飞速发展，可对于患者5年生存率并没有显著提高。更为甚者鼻咽癌的发病机制仍不甚明了。近年来众多研究显示长链非编码RNA(Longnon-coding RNA，lncRNA)对于生命活动的调节功能具有及其重要意义，因此本研究拟主要研究lncRNA PCAT7与鼻咽癌之间的关系。探讨PCAT7在鼻咽癌中的表达变化，明确PCAT7对鼻咽癌细胞生物学活性的影响，并探讨其在鼻咽癌发生发展中所涉及的潜在分子机制。 方法: 第一部分:本研究选取50例鼻咽癌患者的手术取得的肿瘤组织作为实验组，并以其肿瘤组织邻近的正常组织（经病理检查确认）作为对照组，通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测鼻咽癌组织中lncRNA PCAT7的表达。随后，本研究通过6种鼻咽癌细胞系和1种正常鼻咽上皮细胞系在细胞水平进一步展开研究:培养鼻咽癌细胞系CNE-2，HNE-1，C666-1，NONE-1，SUNE-1，CNE-1作为癌性细胞实验组，人鼻咽上皮细胞NP-69作为非癌性细胞系对照组，进行qRT-PCR实验检测PCAT7水平的表达检测。选取表达水平较高的2种细胞系SUNE-1和CNE-1行后续实验。 设计靶向干扰lncRNA PCAT7序列的3条小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)，分别转染SUNE-1和CNE-1细胞，qRT-PCR检测3条siRNA的干扰效率，选择三条中干扰效果最好的一条siRNA行后续功能学研究。通过细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)实验、克隆形成能力实验来研究lncRNA PCAT7对鼻咽癌细胞增殖能力的影响。接着，我们将鼻咽癌细胞株和鼻咽上皮细胞株接种到裸鼠皮下，每隔3天（第4天）测量一次成型瘤体的体积，从而探索lncRNA PCAT7对体内成瘤能力的影响。 第二部分:采用生物信息学软件miRDB预测可能与lncRNA PCAT7发生作用的miRNAs，然后通过生物素化的RNA pull down实验来进一步验证，选择与lncRNA PCAT7相互作用的miRNA进行后续实验的研究。qRT-PCR检测lncRNA PCAT7干扰后miRNA的表达变化，采用双荧光素酶报告实验检测lncRNA PCAT7与miRNA间的调控关系，CCK-8实验检测lncRNA PCAT7和miRNA对鼻咽癌细胞增殖的作用。 为进一步探索miRNA在鼻咽癌细胞增殖中的调控作用，本研究采用生物信息学软件TargetScan对miRNA的靶基因进行预测，随后通过双荧光素酶报告实验进行验证。qRT-PCR及IHC分别检测50例鼻咽癌组织中miRNA及其靶基因的表达变化，western blot检测PCAT7与miRNA对靶基因表达的调控作用。CCK-8实验检测miRNA通过调控其靶基因表达对鼻咽癌细胞增殖的影响。 结果: 第一部分:qRT-PCR结果显示，相对于癌旁组织，PCAT7在鼻咽癌组织(n=50)中表达上调，此外，相对于正常人鼻咽上皮细胞NP-69，PCAT7在6种鼻咽癌细胞系CNE-2，HNE-1，C666-1，HONE-1，CNE-1和SUNE-1中也表达上调，且以在CNE-1和SUNE-1细胞中上调最为明显，因此被用于后续实验的研究，而PCAT7高表达与鼻咽癌患者差的预后呈正相关。随后我们探索PCAT7对鼻咽癌细胞增殖的影响，用siRNA PCAT7转染细胞以沉默PCAT7表达，qRT-PCR结果显示sh-PCAT7-3的干扰效率最好，而被选择用于后续实验研究。CCK-8结果显示sh-PCAT7能够抑制CNE-1和SUNE-1细胞增殖，并抑制CNE-1和SUNE-1细胞克隆形成。接着进一步探索PCAT7沉默在体内对鼻咽癌细胞生长的影响。鼻咽癌动物模型结果显示在瘤细胞接种36天时，相对于sh-NC对照组，sh-PCAT7干扰组肿瘤体积明显减小，并且肿瘤的重量也明显减小。此外，免疫组化结果显示sh-PCAT7干扰组，Ki-67蛋白表达显著降低。综述，我们的结果表明PCAT7沉默在体内外均能够抑制肿瘤生长。 第二部分:我们通过miRDB生物信息学软件对PCAT7的潜在靶miRNAs进行预测，生物素化的RNA pull down实验结果显示PCAT7能够拉出miR-134-Sp，但不能拉出其他潜在的靶miRNAs，因此，miR-134-5p被选择用于后续实验的研究。qRT-PCR检测50例鼻咽癌组织中miR-134-5p的表达，结果显示在鼻咽癌组织中miR-134-5p表达下调，Pearson相关分析结果显示，在鼻咽癌组织中PCAT7与miR-134-5p表达呈显著的负相关。荧光素酶报告实验结果证实miR-134-5p能够与PCAT7特异性的结合位点直接结合。CCK-8结果显示，miR-134-5p能够抑制鼻咽癌细胞增殖，然而当在鼻咽癌细胞中共转染miR-134-5p mimics和pcDNA3.1-PCAT7时，PCAT7能够部分逆转miR-134-5p mimics对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用，然而PCAT7对鼻咽癌细胞增殖的促进作用受到miR-134-5p的抑制，这些结果表明PCAT7通过作为miR-134-5p的ceRNA进而促进鼻咽癌细胞增殖。 接着我们对miR-134-5p在鼻咽癌中的作用机制进行了探索。TargetScan生物信息学软件预测发现ELF2是miR-134-5p的潜在靶基因，western blot结果显示，在CNE-1和SUNE-1细胞中miR-134-5p能够降低ELF2蛋白表达，荧光素酶报告实验证实ELF2是miR-134-5p的直接靶基因。IHC结果显示ELF2在鼻咽癌组织中表达上调，ELF2高表达能够促进鼻咽癌细胞增殖，然而ELF2对鼻咽癌细胞增殖的促进作用受到miR-134-5p的抑制。随后我们对PCAT7与ELF2间的调控关系进行了研究，结果显示，PCAT7可通过吸附miR-134-5p，解除miR-134-5p对ELF2表达的抑制作用，进而促进鼻咽癌细胞增殖。 结论: 我们的结果表明PCAT7在鼻咽癌组织及细胞系中表达均上调，并且其高表达与鼻咽癌患者差的预后呈正相关。干扰PCAT7表达在体外能够抑制鼻咽癌细胞增殖，体内能够抑制肿瘤生长。PCAT7作为miR-134-5p的一种内源性竞争性RNA，能够解除miR-134-5p对其靶基因ELF2表达的抑制作用，进而促进鼻咽癌细胞增殖。总之，我们的结果表明PCAT7在鼻咽癌中可能是一种致癌基因，能够作为鼻咽癌诊断的一种潜在分子标志物，为鼻咽癌的治疗提供新的思路和方法。

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摘要

中英文缩略词表

引言

第一部分lncRNA PCA17在鼻咽癌中的表达及其对鼻咽癌细胞增殖的影响

1.1 实验材料

1.1.1 临床组织标本

1.1.2 实验所用细胞

1.1.3 主要仪器及耗材

1.1.4 主要试剂

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的复苏及培养

1.2.2 lncRNA PCAT7 siRNA转染细胞

1.2.3 组织及细胞总RNA提取

1.2.4 抽提的RNA进行变性琼脂糖电泳检测

1.2.5RNA逆转录

1.2.6 实时荧光定量PCR反应(Real-time PCR)

1.2.7 CCK-8检测细胞增殖

1.2.8 细胞克隆形成实验

1.2.9 鼻咽癌动物模型的建立

1.2.10 样本包埋与固定

1.2.11 免疫组织化学

1.2.12 统计学分析

1.3 结果

1.3.1lncRNA PCAT7在鼻咽癌组织中表达上调

1.3.2 临床病理资料分析结果

1.3.3lncRNA PCAT7在鼻咽癌细胞中表达上调

1.3.4生存分析

1.3.5 siRNA对目的基因的靶向沉默

1.3.6lncRNA PCAT7 -siRNA干扰作用可抑制鼻咽癌细胞增殖和克隆形成

1.3.7lncRNA PCAT7基因表达被干扰可抑制鼻咽癌小鼠模型肿瘤生长

1.3.8lncRNA PCAT7基因沉默可抑制鼻咽癌小鼠模型肿瘤组织中Ki-67的表达

1.4 讨论

第二部lncRNA PCA17调控鼻咽癌细胞机制的初步研究

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 主要仪器及耗材

2.1.3 主要试剂

2.2 实验方法

2.2.1 构建lncRNA PCAT7及ELF2真核表达载体

2.2.2 质粒提取

2.2.3 质粒转染

2.2.4 构建pciCHECK-2-PCAT7及pciCHECK-2-ELF23'UTR表达报告质粒

2.2.5 质粒与miRNA共转染

2.2.6 荧光素酶活性检测

2.2.7 RNA pull down实验

2.2.8 细胞蛋白质提取

2.2.9 蛋白浓度的测定

2.2.10Western blot

2.2.11 统计学处理

2.3 结果

2.3.1 miRDB生物信息学软件对lncRNA PCAT7的靶miRNA进行预测

2.3.2 在鼻咽癌组织中PCAT7表达与miR-134-5p表达呈负相关

2.3.3 在鼻咽癌细胞中PCAT7作为miR-134-5p的一种ceRNA

2.3.4 PCAT7通过吸附miR-134-5p进而促进鼻咽癌细胞增殖

2.3.5 miR-134-5p在鼻咽癌组织中表达下调

2.3.6 ELF2是miR-134-5p的直接靶基因

2.3.7 ELF2是鼻咽癌组织中表达上调

2.3.8 miR-134-5p通过调控ELF2蛋白表达进而抑制鼻咽癌细胞增殖

2.3.9lncRNA PCAT7通过吸附miR-134-5p调控ELF2表达进而促进鼻咽癌细胞增殖

2.4 讨论

结论

参考文献

综述:鼻咽癌组织中的miRNAs的研究进展

攻读博士期间发表论文及科研成果

致谢