长雄蕊野生稻回交渗入系(BILs)基因表达调控研究

摘要

水稻既是世界上重要的粮食作物，又是单子叶植物的模式植物。野生稻具有栽培稻欠缺的很多重要性状，在栽培稻改良中具有潜在的研究价值。通过构建回交渗入系(BILs)，将野生稻中的优良性状导入栽培稻，是一种利用野生稻资源的方法。本研究以长雄蕊野生稻BILs子代中具有不同株高性状的3个株系(L1710、L1817和L1730)和两个亲本（轮回亲本栽培稻和供体亲本长雄蕊野生稻）为实验对象，利用高通量测序技术分别检测并分析了BILs子代株系中基因表达特征，并从miRNA和lncRNA表达的角度分析了非编码RNA对基因表达的调控作用，以期探究野生稻基因渗入对子代基因表达调控以及株高变化的影响。 观察发现长雄蕊野生稻BILs子代L1817和L1730的节间长度长于两个亲本，L1710的节间比栽培稻短。石蜡切片观察结果表明，子代3个株系节间细胞长度均长于两个亲本。结合节间和细胞平均长度，我们计算了节间细胞数目，发现L1710和L1817的节间细胞数目减少，L1730的数目增多。结果表明，子代节间细胞长度和数目的不同导致了BILs子代3个株系的株高差异。 通过RNA-seq技术，我们分析了长雄蕊野生稻BILs子代3个株系与亲本之间基因表达情况，共鉴定出32，084个基因表达，其中21，050个基因在子代和亲本之间共同表达。所有比较组中表达倍数≥5并且FDR≤0.01的基因被判定为差异表达基因，相对于子代与栽培稻比较组，我们在子代与长雄蕊野生稻比较组中发现了更多差异表达基因，并且大部分基因相对于亲本上调表达。亲本偏向性分析表明子代中约80％的基因偏向于轮回亲本表达，可能因为子代基因组中亲本基因组含量的明显差异。另外，通过功能注释分析，我们发现一些植物激素和细胞壁合成代谢相关基因的表达变化可能对子代株高差异具有重要作用，为了解野生稻基因渗入对子代基因表达模式地变化以及株高差异的分子机制奠定基础。 miRNA是植物多个生物过程中一个重要的调控因子。在miRNA表达分析中，我们共鉴定出513个miRNA，其中291个在子代和亲本中均有表达。所有比较组中表达倍数≥2，并且FDR≤0.001的miRNA被定为差异表达miRNA。在子代与长雄蕊野生稻比较组中，差异表达miRNA在数量和差异表达倍数上都高于子代与栽培稻比较组，另外，72％-87％差异表达miRNA偏向轮回亲本表达。结合基因表达研究，我们发现16％-64％差异表达miRNA的靶基因表达变化趋势与其相反，这部分靶基因称为相关靶基因。通过相关靶基因功能注释，我们推测偏向轮回亲本表达的miRNA可能参与子代初级代谢和细胞代谢过程基因的表达调控。另外，我们发现一些miRNA相关靶基因参与植物激素相关过程，这些miRNA可能通过调节激素相关基因的表达调控水稻节间细胞生长，从而影响子代株高变化。 lncRNA是一类无编码能力的RNA，主要通过不同的调控机制调节蛋白编码基因的转录发挥功能。本研究通过高通量测序技术共鉴定出1，254个lncRNA，其中884个在子代与亲本中均有表达。在差异表达分析中，lncRNA差异表达的数量和倍数与子代和亲本间的株高差异正相关，而且一半以上lncRNA的表达具有亲本偏向性。在lncRNA与miRNA和mRNA的整合分析中，大部分lncRNA和mRNA呈正相关调控，而大部分lncRNA和miRNA呈负相关。另外，我们发现少数lncRNA在充当miRNA前体序列的同时，也作为miRNA的诱饵与其结合。在GO功能分析中，lncRNA潜在靶基因显著性富集在“初级代谢”和“应激反应”中，表明lncRNA参与水稻基础生长代谢过程和调节子代的适应性。 总的来说，我们用长雄蕊野生稻BILs子代3个株系和两个亲本为材料，结合大量基因表达以及miRNA和lncRNA表达调控数据，发现BILs子代基因和非编码RNA的表达均具有偏向轮回亲本的特点;功能分析发现部分植物激素和细胞壁合成代谢相关的基因表达变化可能影响子代株高;通过构建基因表达调控网络，认为部分lncRNA通过海绵吸附作用调节miRNA的表达，进而调控生长发育相关基因的表达;这些结果提高了我们对杂交回交过程中基因和非编码RNA表达调控的理解，为深入研究野生稻基因渗入对子代基因表达调控以及株高差异的分子机制奠定基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

第1章文献综述

1．1水稻的研究进展

1．1．1稻属的物种多样性

1．1．2野生稻是重要的种质资源

1．1．3稻属AA基因组物种

1．2水稻回交渗入系(BILs)的研究

1．2．1杂交水稻研究进展

1．2．2水稻BILs的构建及研究手段

1．2．3 BILs构建过程中表观遗传的变化

1．3水稻株高的研究进展

1．3．1水稻株高的类型

1．3．2植物激素对水稻株高变化的影响

1．3．3水稻株高相关基因的研究

1．4非编码RNA的研究

1．4．1植物中非编码miRNA

1．4．2植物中的非编码lncRNA

1．4．3水稻中非编码RNA的研究进展

1．5本研究的目的和意义

第2章长雄蕊野生稻回交渗入系(BILs)基因表达分析

2．1材料与方法

2．1．1水稻材料与生长条件

2．1．2石蜡切片观察

2．1．3 RNA的提取和测序文库的构建以及测序

2．1．4测序原始数据的过滤和参考基因组的比对

2．1．5基因功能注释分析

2．1．6差异表达基因分析

2．1．7实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

2．2结果与分析

2．2．1 BILs子代株系形态特征变化

2．2．2测序数据统计初步分析

2．2．3 BILs子代株系与亲本基因表达情况

2．2．4 BILs子代株系基因表达模式分析

2．2．5 BILs子代株系差异表达基因GO功能分析

2．2．6 KEGG通路分析

2．2．7 qRT-PCR验证

2．3讨论

2．3．1 BILs子代基因表达与其亲本基因组含量密切相关

2．3．2植物激素相关基因的表达变化对BILs子代的株高影响

2．3．3细胞壁相关基因表达变化可能影响BILs子代的株高

第3章长雄蕊野生稻回交渗入系(BILs)miRNA表达分析

3．1材料与方法

3．1．1实验材料

3．1．2提取总RNA以及质量检测

3．1．3构建sRNA文库和sRNA测序

3．1．4原始数据的过滤

3．1．5 miRNA的鉴定

3．1．6 miRNA靶基因预测及靶基因功能注释

3．1．7 miRNA差异表达分析

3．1．8 qRT-PCR验证测序数据的准确性

3．2结果与分析

3．2．1 sRNA测序数据总体概况

3．2．2 BILs子代株系及其亲本miRNA表达鉴定和分析

3．2．3 BILs子代株系差异表达miRNA的分析

3．2．4 miRNA靶基因预测分析

3．2．5 miRNA及靶基因qRT-PCR分析

3．2．6 BILs子代株系miRNA靶基因的GO功能分析

3．3讨论

3．3．1 BILs子代miRNA的表达具有亲本偏向性

3．3．2 miRNA可能通过调节植物激素相关基因表达影响子代株高

第4章长雄蕊野生稻回交渗入系(BILs)lncRNA表达分析

4．1材料与方法

4．1．1实验材料

4．1．2总RNA的提取、质量监控和文库构建及测序

4．1．3测序数据过滤

4．1．4参考基因组的比对和lncRNA的鉴定

4．1．5 lncRNA显著性差异表达分析

4．1．6 lncRNA靶基因和miRNA前体预测

4．1．7 qRT-PCR验证lncRNA测序的准确度

4．2结果与分析

4．2．1 lncRNA测序数据初步分析

4．2．2 lncRNA的序列特征

4．2．3 lncRNA充当miRNA的前体

4．2．4 lncRNA对mRNA调控表达分析

4．2．5 lncRNA与miRNA的相互作用

4．2．6 BILs子代株系差异表达lncRNA分析

4．2．7 BILs子代株系差异lncRNA靶基因的分析

4．2．8亲本偏向性表达分析

4．2．9 BILs子代株系差异表达lncRNA、mRNA和miRNA互作分析

4．3讨论

4．3．1水稻茎秆中lncRNA的特征

4．3．2 lncRNA可能调控BILs子代植物激素相关基因的表达变化

4．3．3 IncRNA可能调节BILs子代的适应性

4．3．4 lncRNA可能通过与mRNA竞争性结合miRNA调控水稻生长

第5章结论与展望

5．1本文主要结论

5．2研究展望

参考文献

攻读博士学位期间发表及投稿论文

致谢