Kv1.3通道阻断剂ImKTx88对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的作用和机制研究

摘要

多发性硬化(multiple sclersosis，MS)是一种以中枢神经系统(central nervous system，CNS)脱髓鞘为特点的自身免疫性疾病，特征性病理改变包括炎性细胞浸润、髓鞘结构破坏、轴索损伤和胶质细胞增生。近年来临床上主要采用免疫抑制剂治疗MS，已取得一定短期疗效，但长期治疗效果仍然不佳。尽管大部分免疫抑制剂能够抑制免疫系统对CNS的攻击，但对已发生的神经损伤却未能有效修复，导致病情进行性加重。研究表明，钾离子Kv1.3通道在MS中的表达大量增加，Kv1.3通道已成为治疗MS的潜在靶点。 Kv1.3电压门控钾通道是Kv1.x亚家族中的一员，存在于免疫细胞和神经细胞胞膜上，对调节免疫细胞和神经细胞的生理功能起着重要作用。T细胞受到自身抗原的反复激活后，穿过血脑屏障，引起CNS炎症反应，是MS形成的重要原因之一。在此过程中，T细胞Kv1.3通道的表达大量增加。虽然已有研究证实Kv1.3通道阻断剂可以缓解MS大鼠模型的发病症状，但是Kv1.3通道阻断剂的研究大多集中在抑制T细胞介导的炎性反应上，对其参与中枢神经保护和调节其它免疫细胞功能方面的研究较少。小胶质细胞作为CNS固有免疫细胞也参与了MS的发生发展，在MS中，小胶质细胞被激活并伴随Kv1.3通道表达显著增加，但小胶质细胞炎性活化与Kv1.3通道表达变化的关联和具体机制仍不明确。 前期工作中，我们筛选出了一种高效特异性的Kv1.3通道阻断剂ImKTx88，本课题将研究其在MS的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠中的神经保护作用，并进一步探讨ImKTx88抑制小胶质细胞炎性活化，减轻神经细胞损伤的效应和分子机制，为MS的治疗提供理论与实验依据。 目的: 研究Kv1.3阻断剂ImKTx88在EAE大鼠中的神经保护作用，并揭示ImKTx88是如何通过抑制小胶质细胞炎性活化，进而减轻其损伤神经细胞的潜在机制。 方法: (1)将脑脊髓匀浆于第0天和第7天两次免疫SD大鼠建立EAE模型。大鼠被随机分为对照组、EAE组和ImKTx88治疗组。第12天，按照100μg/kg的剂量每天皮下注射ImKTx88（治疗组）或同等体积的PBS（对照组和EAE组）。采用双盲法观察并记录各组大鼠行为学评分。第23天处死动物收集脊髓组织。 (2)取腰骶部脊髓组织制成石蜡组织切片，采用免疫组化染色观察白质区域少突胶质细胞丢失、神经轴索损伤和炎性细胞浸润情况。对早期分化阶段少突胶质细胞(NG2)、中晚期分化阶段少突胶质细胞(CC-1)和成熟少突胶质细胞(MBP)进行免疫组化染色观察髓鞘细胞丢失情况;对神经轴索进行神经丝蛋白NF200和β-淀粉样前体蛋白APP染色观察神经轴索损伤情况;对T淋巴细胞、星形胶质细胞、中性粒细胞和小胶质细胞分别进行CD3、GFAP、MPO、CD68/Iba-1免疫组化染色观察它们在脊髓中的浸润情况。双重免疫荧光标记CD68和Kv1.3检测各组大鼠脊髓组织中活化的小胶质细胞Kv1.3通道的表达。 (3)对各组大鼠脊髓组织进行LFB染色，观察脊髓白质脱髓鞘程度;透射电镜超微结构分析各组大鼠脊髓白质中的髓鞘和神经轴索结构。 (4)通过ELISA方法检测各组大鼠脊髓组织匀浆中促炎细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-6)的含量。采用LPS、LPS+不同浓度ImKTx88处理BV2小胶质细胞，ELISA检测细胞培养上清中TF-α和IL-6的含量。 (5)采用LPS、LPS+不同浓度的ImKTx88分别处理BV2小胶质细胞，取细胞培养上清分别与原代纯化培养的少突胶质细胞和神经元孵育24h，CCK8检测少突胶质细胞和神经元的生存以及TUNEL染色检测少突胶质细胞和神经元的凋亡情况。 (6)qPCR、Western blot和免疫细胞荧光检测对照组、LPS组和LPS+不同浓度ImKTx88组中BV2小胶质细胞Kv1.3通道的表达。Western blot检测各组BV2小胶质细胞中信号通路关键分子MyD88、TRAF6和p65蛋白的表达。 结果: (1)对照组大鼠在整个实验过程中无发病症状，EAE组大鼠从第一次免疫后第12天开始出现肢体瘫痪症状，且进行性加重，而ImKTx88治疗显著缓解EAE大鼠发病症状，降低行为学评分。 (2)免疫组化标记不同分化阶段的少突胶质细胞结果显示:EAE组中，NG2、CC-1和MBP阳性细胞数量较对照组显著降低，而ImKTx88治疗组中，上述阳性细胞数量较EAE组均明显增加。 (3)免疫组化标记神经轴索和电镜超微结构分析神经纤维结果显示:EAE组NF200的表达较对照组明显降低，β-APP在病灶区表达显著提高。ImKTx88治疗组NF200的表达明显提高，β-APP在病灶区的表达显著降低。电镜观察神经纤维超微结构显示，EAE组中神经轴索密度、髓鞘厚度显著降低，而G-ratio值显著升高。ImKTx88治疗组中神经轴索密度、髓鞘厚度明显增加，G-ratio值显著降低。结果提示，ImKTx88减少EAE大鼠髓鞘细胞和神经轴索的丢失与破坏。 (4)免疫组化标记脊髓中的炎性细胞和ELISA检测促炎细胞因子含量的结果显示:EAE组中浸润的CD3、GFAP、MPO和CD68/Iba-1阳性细胞的数量与对照组相比显著增加，而ImKTx88治疗组与EAE组相比，上述炎性细胞数量明显降低。ELISA结果显示:EAE组大鼠脊髓中促炎细胞炎性因子IL-6、TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量与对照组相比显著升高，而ImKTx88治疗组与EAE组相比，上述促炎细胞因子的含量明显降低。结果提示，ImKTx88能够抑制EAE大鼠的CNS炎性反应。 (5)双重免疫荧光标记显示:EAE组脊髓中活化的小胶质细胞Kv1.3通道表达明显升高，而ImKTx88治疗组中小胶质细胞的Kv1.3通道表达显著降低。在细胞学水平上，LPS激活的BV2小胶质细胞中Kv1.3的表达显著升高，给予ImKTx88处理后，Kv1.3通道的表达明显降低。此外，ELISA检测BV2小胶质细胞培养上清促炎细胞因子的结果显示:不同浓度的ImKTx88处理由LPS激活的BV2小胶质细胞24h后，BV2小胶质细胞培养上清中IL-6和TNF-α的水平明显降低。qPCR结果表明，ImKTx88抑制活化的BV2小胶质细胞IL-6和TNF-α的转录。同时，CCK8和TUNEL染色的结果表明，ImKTx88抑制炎性上清损伤少突胶质细胞和神经元产生的凋亡。 (6)Western blot检测BV2小胶质细胞中信号通路蛋白表达的结果显示:LPS组与对照组相比，MyD88、TRAF6和p-p65蛋白表达显著升高，而LPS+ImKTx88组与LPS组相比，上述蛋白的表达明显降低。结果提示，ImKTx88可能通过阻断MyD88/TRAF/NF-κB信号通路抑制小胶质细胞的活化。 结论: 本研究发现Kv1.3通道阻断剂ImKTx88能够缓解EAE大鼠发病症状，抑制炎性反应，减轻髓鞘丢失和神经轴索损伤。研究进一步证实，ImKTx88通过抑制Kv1.3通道降低BV2小胶质细胞的活化，减轻BV2小胶质细胞炎性活化导致的神经细胞损伤，其作用机制可能是通过下调小胶质细胞中的MyD88/TRAF6/NF-κB信号通路抑制其炎性活化。以上研究提示Kv1.3通道阻断剂ImKTx88对于MS的临床治疗具有潜在的应用前景。

目录

声明

中英文缩略词表

摘要

引言

一．多发性硬化的概念与分类

二．MS的发病机制与治疗

三．小胶质细胞的炎性活化与MS

四．Kv1．3通道与小胶质细胞的功能

五．Kv1．3通道阻断剂在MS治疗中的研究

六．本研究工作的出发点

第一部分ImKTx88对实验性自身免疫性脊髓炎大鼠的作用研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

本部分小结

第二部分ImKTx88对小胶质细胞活化的抑制作用及机制研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

本部分研究小结

全文研究工作总结

参考文献

综述 多发性硬化中小胶质细胞活化介导神经损伤的研究进展

攻读博士期间发表论文及所获奖项

致谢