趋化因子受体9(CCR9)在心肌梗死后心室重构中的作用及机制研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分:CCL25/CCR9参与心肌梗死后心脏重构的研究 目的:探讨CCL25/CCR9是否参与心梗后心室重构。 方法:选择体重在24-27g，8-10周龄的C57BL/6雄性野生型小鼠(wild type，WT)通过结扎冠状动脉左前降支建立小鼠心梗模型，实验对象分三组:假手术组（Sham组），心梗后3天组(MI/3d)，心梗后1周组(MI/1W)。RT-PCR及Western blot检测CCR9及CCL25在梗死心肌组织中的表达水平。免疫组化法检测CCR9及CCL25表达水平及表达部位。免疫荧光双标记法检测表达CCR9的细胞种类。 结果:与sham组相比，RT-PCR及Western blot检测显示心梗后3天和1周的小鼠心肌组织中的CCR9和CCL25表达显著升高。免疫组化也显示CCR9及CCL25表达显著升高，并且主要表达在梗死区及梗死周边区。免疫荧光双标记法进一步显示CCR9主要表达于CD68+和CD3+细胞表面。 结论:心梗后心肌组织中CCR9及CCL25表达显著升高，并且主要表达于梗死区及梗死周边区的CD68+和CD3+细胞表面，我们由此推测CCR9及CCL25参与了心梗后的病理过程，可能通过参与炎症反应影响心室重构。 第二部分: CCR9基因敲除对小鼠心梗后心室结构重构的影响及机制 目的:探讨CCR9基因敲除对小鼠心梗后心室结构重构的影响及机制 方法:选择体重在24-27g，8-10周龄的CCR9基因敲除(CCR9-/-)小鼠和同窝野生型小鼠(CCR9+/+)建立小鼠心梗模型，实验对象分四组:野生型小鼠假手术组(CCR9+/+ Sham组)，基因敲除小鼠假手术组(CCR9-/-Sham组)，野生型小鼠心梗后1W组(CCR9+/+ MI 1W组)，基因敲除小鼠心梗后1W组(CCR9-/-MI1W组)。模型成功后，每天观察各组小鼠的生存状态，统计死亡数量，绘制生存曲线图。超声心动图评价心肌梗死后1W小鼠心功能。测定小鼠体重(bodyweight, BW)、心脏重量(heart weight, HW)、肺脏重量(LW)及胫骨长度(tibia length，TL)。HE染色用于观察梗死周边区心肌细胞大小形态及测量心肌梗死面积，天狼星红染色用于观察心肌间质胶原沉积及胶原容积分数的计算。RT-PCR检测梗死周边区心肌组织中肥大相关指标(ANP、BNP、β-MHC)及纤维化指标(CTGF、CollageI、CollageⅢ)的RNA水平。WB检测梗死周边区心肌组织中MAPK信号通路相关蛋白——ERK1/2，JNK1/2，P38的总蛋白水平及磷酸化水平。 结果:与Sham组相比，心梗小鼠生存率显著下降，CCR9-/-MI1W组小鼠生存率较CCR9+/+ MI 1W组生存率有改善趋势。HE染色显示CCR9-/-MI1W组小鼠心梗面积较CCR9+/+ MI 1W组显著减小。超声心动图显示，与Sham组相比，心梗后一周小鼠心脏功能显著下降，左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVSDd)显著增加，短轴缩短率(FS)及左室射血分数(LVEF)均降低。但CCR9-/-MI 1W组小鼠心脏功能较CCR9+/+ MI 1W组显著改善，左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVSDd)显著减小，短轴缩短率(FS）及左室射血分数(LVEF)均升高。与Sham组相比，CCR9+/+ MI 1W组HW/BW、LW/BW、HW/TL显著增加，与CCR9+/+ MI 1W组相比，CCR9-/-MI 1W组HW/BW、LW/BW、HW/TL均有所降低。与Sham组相比，HE染色显示CCR9+/+MI 1W组心肌细胞横截面积显著增加，与CCR9+/+ MI 1W组相比，CCR9-/-MI 1W组心肌细胞横截面积减小，且形态趋于正常。与Sham组相比，CCR9+/+ MI 1W组心肌肥大相关指标ANP、BNP、β-MHC表达升高，与CCR9+/+ MI 1W组相比，CCR9-/-MI 1W组心肌肥大相关指标ANP、BNP、β-MHC表达降低。与Sham组相比，PSR染色显示CCR9+/+ MI1W组心肌间质胶原沉积显著增加，与CCR9+/+ MI 1W组相比，CCR9-/-MI 1W组心肌间质胶原沉积减少。与Sham组相比，CCR9+/+ MI 1W组纤维化相关指标CTGF、CollageI、CollageⅢ表达升高，与CCR9+/+MI1W组相比，CCR9-/-MI 1W组纤维化相关指标CTGF、CollageI、CollageⅢ表达降低。与Sham组相比，Western blot结果显示CCR9+/+ MI 1W组梗死周边区心肌组织中MAPK信号通路相关蛋白——ERK1/2，JNK1/2，P38的磷酸化表达水平显著升高，与CCR9+/+ MI 1W组相比，CCR9-/-MI 1W组ERK1/2，JNK1/2，P38的磷酸化表达水平降低。 结论:CCR9参与小鼠心梗后心室结构重构，CCR9基因敲除减小心梗面积，改善心功能，改善小鼠心梗后生存率。CCR9基因敲除改善心梗后心肌肥大和心肌纤维化。CCR9基因通过调节MAPK信号通路参与心梗后心室结构重构调节。 第三部分: CCR9基因敲除对小鼠心肌梗死后炎症反应及心肌细胞凋亡的影响及机制 目的:探讨CCR9基因敲除对小鼠心梗后炎症反应及心肌细胞凋亡的影响及机制 方法:选择体重在24-27g，8-10周龄的CCR9基因敲除(CCR9-/-)小鼠和同窝野生型小鼠(CCR9+/+)建立小鼠心梗模型，实验对象分四组:野生型小鼠假手术组(CCR9+/+ Sham组)，基因敲除小鼠假手术组（CCR9-/-Sham组），野生型小鼠心梗后1W组(CCR9+/+ MI 1W组)，基因敲除小鼠心梗后1W组(CCR9-/-MI 1W组)。模型成功后，免疫组化法检测梗死边缘区心肌组织中巨噬细胞及T淋巴细胞的变化;RT-PCR检测小鼠梗死周边区心肌组织中炎症因子IL-1β、TNF-a、IL-6 RNA的表达水平;western blot检测NF-kB信号通路蛋白——p65和IkBa蛋白激酶的总蛋白及磷酸化表达水平。 结果:与Sham组相比，CCR9+/+ MI 1W组心梗周边区CD68及CD3阳性细胞浸润数量增加，与CCR9+/+ MI 1W组相比，CCR9-/-MI 1W组CD68及CD3阳性细胞浸润数量减少。与Sham组相比，CCR9+/+ MI 1W组组心梗周边区IL-1β、TNF-a、IL-6 RNA的表达升高，与CCR9+/+ MI1W组组相比，CCR9-/-MI 1W组心梗周边区IL-1 β、TNF-a、IL-6 RNA的表达降低。与Sham组相比，Western blot结果显示CCR9+/+ MI 1W组梗死周边区心肌组织中NF-kB信号通路蛋白——p65和IkBa蛋白激酶的磷酸化表达水平显著升高，与CCR9+/+ MI 1W组组相比，CCR9-/-MI 1W组p65和IkBa的磷酸化表达水平降低。 结论:CCR9通过参与NF-kB信号通路调节心梗后炎症反应。CCR9基因敲除可减轻心梗后炎症反应，从而改善心梗后心室结构重构。 第四部分: CCR9对小鼠心肌梗死后心脏电重构的影响及机制 目的:探讨CCR9基因敲除对小鼠心梗后心脏电重构的影响及机制 方法:选择体重在24-27g，8-10周龄的CCR9基因敲除(CCR9-/-)小鼠和同窝野生型小鼠(CCR9+/+)建立小鼠心梗模型， 实验对象分四组:野生型小鼠假手术组（CCR9+/+ Sham组），基因敲除小鼠假手术组（CCR9-/-Sham组），野生型小鼠心梗后1W组(CCR9+/+ MI 1W组)，基因敲除小鼠心梗后1W组(CCR9-/-MI 1W组)。模型成功后，遥测心电图技术检测24h动态心电图观察心率及心律失常发生情况;运用Langendorff离体电生理技术，对离体心脏给予S1S1程控刺激检测动作电位时程，动作电位电交替和室性心律失常诱发情况;western blot检测心梗周边区心肌组织缝隙连接蛋白CX43表达水平。 结果:与Sham组相比，CCR9+/+ MI 1W组及CCR9-/-MI 1W组RR间期、PR间期无差异，QRS间期、QT间期及QTc间期均延长，但CCR9+/+ MI 1W组与CCR9-/-MI 1W组间无差异。与sham组相比，CCR9+/+MI 1W组APD90 (PCL=150ms)显著延长，与CCR9+/+ MI 1W组相比，CCR9-/-MI 1W组APD90 (PCL=150ms)缩短。与sham组相比，CCR9+/+ MI 1W组动作电位时程电交替诱发阈值明显降低，与CCR9+/+ MI 1W组相比，CCR9-/-MI 1W组动作电位时程电交替诱发阈值升高。与sham组相比，CCR9+/+ MI 1W组室性心律失常诱发率明显升高，与CCR9+/+ MI 1W组相比，CCR9-/-MI 1W组室性心律失常诱发率降低。与sham组相比，CCR9+/+ MI 1W组心梗周边区心肌组织缝隙连接蛋白CX43表达降低，与CCR9+/+ MI 1W组相比，CCR9-/-MI 1W组CX43表达升高。 结论: CCR9基因敲除可能通过抑制缝隙连接蛋白CX43降解，减轻心肌细胞解偶联，从而抑制心律失常发生。

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摘要

主要英文缩略词汇表

引言

第一部分：CCL25／CCR9在小鼠心梗后不同时间点心肌组织中的表达及意义

材料与方法

结果

讨论

附图

第二部分：CCR9基因敲除对小鼠心梗后心室结构重构的影响及机制

材料与方法

结果

讨论

附图

第三部分： CCR9基因敲除对小鼠心梗后炎症反应及心肌细胞凋亡的影响及机制

材料与方法

结果

讨论

附图

第四部分：CCR9基因敲除对小鼠心梗后心室电重构的影响及机制

材料与方法

结果

讨论

附图

参考文献

综述:心肌梗死后的炎症治疗：抗炎之战的前车之鉴与后事之师

博士期间发表的论文

致谢