HPV与色素改变性皮肤疾病之间的关系研究

摘要

目的:本课题研究目的是在前人的研究基础之上,收集脂溢性角化病和色素痣的临床标本,提取总DNA,应用HPV特异型和通用型引物对进行扩增,检测标本中某些型别HPV DNA的存在与否,制作石蜡切片,应用两种针对HPV L1蛋白的抗体进行免疫荧光试验,检测标本中HPV L1蛋白的存在与否,从基因和蛋白两个水平研究脂溢性角化病和色素痣皮损中HPV的存在情况,及其存在与病损的发生有无相关性。
　　方法:(1)收集脂溢性角化病和色素痣石蜡标本,确定其临床诊断和病理诊断,将同一标本分成两部分,一部分以4um厚连续切片,捞片,另外一部分以10um厚连续切片,5片,装入1.5ml的EP管中;(2)对所有标本提取总DNA,采用PCR方法检测HPV病毒基因的存在与否,确定HPV DNA阳性检出率;(3)对相同的所有标本以本课题组所制备的兔抗HPV L1多克隆抗体及购买的小鼠抗HPV L1单克隆抗体为一抗进行免疫荧光检查,检测组织中HPV L1蛋白的存在情况及阳性检出率;(4)采用统计学软件,综合分析以上实验结果,确证脂溢性角化病和色素痣中HPV的存在情况,探讨HPV在上述疾病发病机制中所发挥的作用。
　　结果:(1)共收集脂溢性角化病石蜡标本46例,色素痣52例;(2)PCR中,对所有标本提取总DNA后均进行β-globin基因扩增,脂溢性角化病阳性者38例,色素痣阳性者44例,对所有β-globin基因扩增阳性的标本进行HPV16 E6,HPV18 E6扩增后再进行HPV L1通用型引物对MY09/11,GP5+/6+扩增,每个引物扩增重复两遍,结果38例SK中有一例HPV16 DNA弱阳性,检出率为2.63％,其余标本全部为阴性;(3)脂溢性角化病标本进行免疫荧光检测,兔抗HPV L1多克隆抗体为一抗时,阳性部位主要在上皮未角化部,阳性者共24例,HPV LI蛋白检出率为63.16％,鼠抗HPV L1单克隆抗体为一抗时,阳性主要表达在上皮角化层及真皮角化珠内,阳性者共20例,HPV LI蛋白检出率为52.63％。色素痣标本进行免疫荧光检测,兔抗HPV L1多克隆抗体为一抗时,阳性主要表达在上皮未角化部及汗腺内,阳性者共22例,HPV LI蛋白检出率为50.00％,鼠抗HPV L1单克隆抗体为一抗时,阳性主要表达在上皮角化层及毛囊内,阳性者共20例,HPV LI蛋白检出率为45.45％;(4)统计学分析显示,脂溢性角化病和色素痣标本中HPV DNA检出率与HPV L1蛋白检出率的差异有统计学意义。
　　结论:(1)本实验中脂溢性角化病标本中除HPV16外其他的HPV DNA的检出率为零,由于HPVL1通用型引物MY09/11,GP5+/6+扩增型别是有限的,是否有其他型别HPV DNA的存在需要进一步证实,但是HPV LI蛋白的检出率较高,分析得出HPV尤其是高危型与其发病机制不相关,某些皮肤型HPV可能在组织中存在。(2)色素痣石蜡标本中基因和蛋白水平的检测,得出的结论与脂溢性角化病相似。(3)两种HPV LI抗体的阳性表达部位的不同,提示抗体的差异,同时显示皮肤标本中角化层与未角化层均存在HPV LI蛋白的表达,至于两种抗体为何定位不同值得进一步探讨;两种抗HPV L1蛋白抗体检测两种病变组织HPV L1的表达情况,实验结果经过比较可证实本课题组研制的兔抗检测能力可与购买的鼠抗相当。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩略词表

引 言

材料与方法

1 主要实验器材

2 临床标本收集

2.1 标本收集地点

2.2 标本例数及分类

2.3 保存方式

3 临床标本聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测

3.1 试剂及其配制

3.2 细胞培养

3.3 细胞的收集及总 DNA 的提取

3.4 标本总 DNA 的提取

4 标本免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）检测

4.1 试剂及其配制

4.2 临床标本石蜡切片的制备

4.3 实验分组设计

4.4 组织切片 HE 染色

4.5 标本中 HPV L1 蛋白免疫荧光技术检测步骤

4.6 免疫荧光结果判断标准

结果

1 标本 PCR 结果

1.1 标本内参照 β-globin 基因引物对扩增结果

1.2 HPV16 E6 引物对扩增结果

1.3 HPV18 E6 引物对扩增结果

1.4 HPV L1 通用型引物对 MY09/11 扩增结果

1.5 HPV L1 通用型引物对 GP5+/6+扩增结果

1.6 临床标本 PCR 实验结果与分析

2 标本免疫荧光检测结果及分析

讨论

1 HPV 病毒概述

2 HPV 对黑色素细胞的影响

3 HPV 与 SK 的相关性

4 HPV 与色素痣的相关性

结论

展望

参考文献

综 述

后 记

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著