华蟾素对H22肝癌细胞诱导免疫细胞合成释放β-END的影响

摘要

目的：建立小鼠脾淋巴细胞和小鼠H22肝癌细胞体外共培养模型,使用华蟾素干预共培养模型,观察上清液中β-END和细胞因子CRF含量,检测免疫细胞内POMC和CTSL的基因表达,探索华蟾素对免疫细胞的增殖促进作用和趋化作用。从而为华蟾素从β-END-μ-POMC途径治疗癌痛的机制研究提供理论依据。
　　方法：(1) 提取小鼠脾淋巴细胞,制备小鼠H22肝癌腹水细胞,体外将两种细胞按照一定浓度比共培养。(2) ELISA法测定华蟾素促进免疫细胞释放β-END的含量来选择测定指标的最佳时间以及共培养的最佳浓度比。ELISA法测定华蟾素对共培养模型上清液中细胞因子含量的影响。(3) MTT法和细胞计数法比较华蟾素对免疫细胞和肝癌细胞生长情况的影响。(4) 荧光定量PCR检测免疫细胞中POMC和CTSL的基因表达水平。(5) Transwell趋化实验测定华蟾素对免疫细胞的趋化作用。
　　结果：(1) 成功建立小鼠脾淋巴细胞和H22肝癌腹水细胞的体外共培养模型。(2)根据华蟾素促进免疫细胞释放β-END的含量选择测定指标的最佳共培养时间为24h,脾淋巴细胞和H22肝癌细胞的最佳浓度比为10：1。且不同浓度华蟾素均能显著性地增加共培养模型上清液中β-END的含量(P<0.01)。(3) 不同浓度的华蟾素均能明显促进免疫细胞以及共培养后的免疫细胞的增殖,与空白对照组相比,二者在24h、48h均具有显著性统计学差异(P<0.01)。不同浓度的华蟾素对H22肝癌细胞和共培养后的H22肝癌细胞均有抑制作用(P<0.01)。(4) 荧光定量PCR检测华蟾素1/40能够显著促进免疫细胞中POMC和CTSL的基因表达水平,与对照组相比,具有显著性统计学差异(P<0.01)。(5) Transwell趋化实验测定华蟾素对免疫细胞有明显的趋化作用。
　　结论：在体外的小鼠脾淋巴细胞和H22肝癌细胞共培养模型中,华蟾素能够促进共培养上清液β-END和细胞因子CRF的含量,增加β-END的前体蛋白POMC和CTSL的基因表达水平。华蟾素能够抑制肝癌细胞的同时促进免疫细胞的增殖作用和趋化作用。推测华蟾素可能通过提高β-END的合成和释放,并且促进免疫细胞的增殖和募集,从β-END-μ-POMC途径发挥局部镇痛作用。

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引言

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂及设备

1.2 实验方法

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 细胞形态及共培养模型观察

2.2 ELISA法测定时间和浓度比对华蟾素促进免疫细胞释放β-END 的影响

2.3 华蟾素对免疫细胞的增殖作用及对肝癌细胞的抑制作用

2.4 华蟾素对免疫细胞的趋化作用

2.5 ELISA法检测华蟾素对共培养上清液中细胞因子的影响

2.6 实时荧光定量PCR检测华蟾素对免疫细胞中POMC和CTSL的基因表达的影响

3 讨论

3.1 关于体外细胞共培养模型

3.2 关于趋化实验

3.3 关于本课题的思路

3.4 对课题结果的讨论

小结

参考文献

综述

致谢

附录：攻读硕士学位期间发表的部分学术论著