实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研究

摘要

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)为嗜肝DNA病毒，是引起乙型病毒性肝炎(以下简称“乙肝”)的病原体，其基因组为闭合环状双链DNA，大小为3.2kb，在负链DNA核苷酸序列为模板转录的RNA上含有四个ORF，分别称为S、C、P、X区。乙肝呈世界性流行，是严重危害人类健康的传染病，我国是高发区，乙肝防治形势严峻。HBV传染途径包括由血液传播、性传播、母婴传播。早期诊断可以提高HBV感染者获得治愈的机会、减少交叉感染和HBV传播，对传染病的预防控制有着重要意义。目前HBV的检测可分为病毒抗原检测和病毒DNA检测。病毒抗原检测主要应用现症HBV感染检测。病毒DNA检测是通过定性或定量检测体内HBV DNA的病原学诊断手段，临床应用包括病毒载量的检测等。检测HBV DNA在乙肝的预防和诊治过程中有重要意义。 实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)技术是在PCR扩增反应过程中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它具有定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反应后不需电泳检测等优点。该技术自发明以来，被广泛地应用于DNA或RNA绝对定量分析、基因表达差异分析和肿瘤基因检测等多个学科领域。用此技术对HBV DNA载量进行分析，其临床意义可用于治疗前后监测、药物疗效考核和治疗效果评价。 本研究通过对HBV前C区、C区和X区保守序列区段设计引物，分别扩增含有3个HBV基因组pBR322质粒中的HBV目的序列；通过AT亚克隆至基因组大小接近于HBV基因组的pBS-T载体中。前C区、C区和X区目的片段大小分别为113bp、101bp和57bp。经过蓝白斑筛选和菌落PCR初步鉴定目的亚克隆子并测序验证。经BLAST同源比对分析，成功地获得了预期希望的新的亚克隆子。所获的新的带有HBV保守序列的亚克隆子比原始质粒有更高的拷贝数，有效地解决了标准品的来源。对3个保守序列进行了常规PCR退火温度的优化和灵敏度的检测，选择灵敏度最高的前C区保守序列作为目的检测序列。以含有前C区保守序列的pBS-T质粒DNA为模板，建立TaqMan探针FQ-PCR反应体系，制备标准曲线。所生成的标准曲线相关系数为0.995，可信度高。线性范围5×10<'3> copies/μl～5×10<'9>copies/μl。批内、批间变异系数值均小于5％，精确度高，重复性好。 本研究的后续工作是临床应用。

目录

文摘

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论文说明：缩写词

声明

一、引言

1.乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)

1.1 HBV发现简史

1.2 HBV的基因组特征

1.3 HBV流行现状

1.4 HBV检测方法

2.实时荧光定量PCR(Real-time Fluorescent Quantitative PCR，FQ-PCR)

2.1 FQ-PCR原理

2.2 FQ-PCR的特点

2.3 FQ-PCR的定量方法

2.4影响FQ-PCR的主要因素

2.5常用的FQ-PCR仪

2.6 FQ-PCR在分子生物学领域中的应用

2.7实时荧光定量PCR技术存在的不足

3.本课题研究的目的和意义

二、材料与方法

1.实验材料

1.1质粒和菌株

1.2培养基

1.3主要试剂

1.4主要溶液

2.实验方法

2.1引物和探针设计

2.2 PCR扩增pBR322-HBV质粒前C区、C区和X区保守序列

2.3 AT亚克隆

2.4菌落PCR筛选阳性克隆和测序

2.5 HBV-DNA荧光定量PCR定量DNA标准的制备

2.6 HBV-DNA荧光定量PCR定量检测标准曲线的制备

2.7 HBV-DNA荧光定量PCR检测线性范围、精度和重复性确定

三、实验结果

1.从pBR322-HBV质粒中扩增目的片段

1.1前C区和C区目的片段扩增

1.2 X区目的片段扩增

2.阳性亚克隆的菌落PCR初步鉴定及测序结果

2.1前C区和C区阳性亚克隆子菌落PCR电泳检测及测序

2.2 X区阳性亚克隆子菌落PCR电泳检测及测序

3.HBV-DNA标准品制备

4.常规PCR检测灵敏度

4.1常规PCR检测前C区条件的优化及灵敏度

4.2常规PCR检测C区条件的优化及灵敏度

4.3常规PCR检测X区条件的优化及灵敏度

5.HBV-DNA荧光定量PCR检测标准曲线

6.HBV-DNA荧光定量PCR精度

7.HBV-DNA荧光定量PCR重复性

四、讨论

1.亚克隆分析

2.常规PCR分析

3.HBV-DNA FQ-PCR检测效果评价

4.后续工作

参考文献

在校期间发表的论文

致谢